في البكتيريا ، تتطلب دراسة ديناميات بروتينات انقسام الخلايا اتجاها مكانيا للخلايا. على سبيل المثال ، في حالة الحلقة Z ، المكون الرئيسي في انقسام الخلايا البكتيرية ، يعد الاتجاه الرأسي أمرا أساسيا لتسجيل الهيكل بأكمله في المستوى XY. في هذا الفيديو، نطور طريقة لتحقيق هذا التوجه المحدد في البكتيريا الزرقاء الخيطية أناباينا.
Anabaena هو كائن ضوئي متعدد الخلايا ، ويشترك مع البكتيريا الأخرى في القدرة على استخدام ثنائي النيتروجين في الغلاف الجوي كمصدر للنيتروجين. في غياب هذا العنصر ، يميز Anabaena الخلايا المتخصصة في تثبيت النيتروجين. لذلك ، فإنه يوفر نموذجا ممتازا لتحليل العلاقة بين الانقسام الخلوي وتعدد الخلايا.
أولا ، حدد مكونا ثنائيا موجودا في سلالة البكتيريا الزرقاء الخيطية المستهدفة. بالنسبة للتجربة ، من الضروري بناء طفرة بكتيرية زرقاء خيطية تعبر عن المكون الثنائي المحدد المنصهر في بروتين الفلورسنت. في هذا البروتوكول ، نستخدم متحولة Anabaena التي تعبر عن FtsZ المنصهر في GFP كمثال.
أولا ، قم بعمل ثقافة فرعية جديدة من الطافر مع 10 ملليلتر من الثقافة في المرحلة الثابتة ، و 90 ملليلتر من الوسط السائل. ثم تنمو ثقافة الخلية الجديدة في ضوء ثابت وفي درجة الحرارة المثلى ، حتى تصل إلى المرحلة الأسية. في مثالنا ، نمت الطافرة عند 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
الآن تأخذ ملليلتر من ثقافة النمو ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 2،500 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تحقق من أن جميع الخلايا موجودة في قاع الأنبوب.
كن حذرا أثناء التعامل مع العينات ، لتجنب إعادة التعليق. سخني محلول الأغاروز منخفض درجة الانصهار بنسبة 3٪ في الميكروويف. من المهم القيام بذلك في فترات زمنية قصيرة ، والتحقق من الحل حتى السائل تماما.
بمجرد ذوبانه ، اتركه جانبا ليبرد. خذ أنابيب الطرد المركزي للخطوة السابقة ، وتخلص من 1.9 ملليلتر من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في الحجم المتبقي عن طريق سحب ثلاث مرات على الأقل لأعلى ولأسفل. في مكان عملك ، ضع الأنبوب مع الخلايا ، ومحلول الأغاروز المذاب ، وحقنة سعة ملليلتر واحدة مقطوعة في الحافة ، ومشرط بشفرة جديدة ونظيفة.
ثم امزج الخلايا مع 900 ميكرولتر من محلول الأغاروز 3٪ عن طريق سحب ثلاث مرات على الأقل. من المهم حقا التأكد من أن محلول الأغاروز ليس ساخنا جدا ، ولكنه يظل سائلا. مع هذا ، نحن نتجنب تلف الخلايا خلال هذه العملية.
يجب أن تتم الخطوة التالية بسرعة ، وقبل أن يتلاشى محلول الأغاروز. تمتص مصفوفة الأغاروز في حقنة سعة ملليلتر واحد بعناية. من المهم تجنب توليد الفقاعات أثناء امتصاص العينة.
بعد ذلك ، احتضان العينة ، ووضع المحقنة في وضع أفقي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة المصفوفة بعناية مع الخلايا باستخدام المكبس في سطح نظيف ومستو. باستخدام المشرط ، قم بتقطيع عينة الجل إلى شرائح رقيقة قدر الإمكان ، مع الحفاظ على سلامة المصفوفة.
ثم قم بإيداع العينات في قسيمة الغطاء المقابلة ، جنبا إلى جنب. كما هو موضح في الفيديو ، في هذه الخطوة ، يمكنك استخدام تلميح للمساعدة في عملية معالجة العينة. بالنسبة لتجارب الفاصل الزمني ، يوصى باستخدام غرفة الخلية المصنوعة للتحليل المجهري.
في هذه الحالة ، نستخدم أغطية دائرية تتناسب مع هذا النوع من الغرف ، كما ترون في الفيديو. أخيرا ، لمنع جفاف العينة ، أضف حجما إضافيا من محلول الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ داخل الغرفة. قبل التصوير ، انتظر حتى يتم هلام الأغاروز تماما.
الآن ضع الغرفة مع الخلايا في المجهر للتصوير. يوصى باستخدام جهاز للتحكم في درجة الحرارة والرطوبة. تصور العينة في حقل ساطع بأقصى تكبير ، وابحث عن خيوط موجهة رأسيا.
يمكنك العثور على موقع التقسيم محل الاهتمام من خلال مسح أولي باستخدام إشارة التألق الذاتي على طول المستوى Z. باستخدام هذا ، استخدم معلمات علامة البروتين الفلورية الخاصة بك لتصور إشارة البروتين الذي يهمك في موقع التقسيم. يمكنك الآن إجراء تجارب الفاصل الزمني وفقا للنموذج البيولوجي والبروتين محل الاهتمام.
في هذه الحالة ، يمكننا أن نرى الهيكل الكامل للحلقة Z في متحولة FtsZ-GFP ، في المستوى XY. باستخدام طريقتنا ، تمكنا من تسجيل ديناميكيات هذه الحلقات في فترة زمنية طويلة. أخيرا ، مع التغيرات في شدة التألق ، نستنتج أن هذا الهيكل ديناميكي للغاية في نموذجنا.
هذه الطريقة هي بروتوكول سريع وغير مكلف لتسجيل ديناميكيات البروتين في موقع الانقسام عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر المطبق على الأشكال المعقدة كبكتيريا زرقاء خيطية ، باستخدام Anabaena كنموذج.
