نود أن نعرب عن تقديرنا لالمدخلات والتعليقات من أعضاء مختبر باديلا. وقدمت سلالات النيماتودا في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). نعترف ونشكر الدكتور لون تيرنبول للمساعدة التقنية مع المجهري متحد البؤر. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF-IOS، والوظيفي) لPAP

1. تحضير العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج أو الحصول على المناسبة المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالة من الفائدة المعدلة وراثيا باستخدام منهجيات أو من Caenorhabditis مركز علم الوراثة الأسهم (CGC) أو زميل. في هذه الحالة نستخدم سلالة TH32 (فطيرة-1-1 :: TBG :: GFP؛ فطيرة-1 :: GFP :: H2B) 5 لتصور الكروموسومات وcentrosomes كعلامات لانقسام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد عدد سكانها متزامنة باستخدام واحدة من ثلاث طرق: 1) تتفكك البالغين حامل في محلول هيبوكلوريت واستخدام الأجنة المتبقية 6، 2) اختيار أشخاص على حامل لوحة المصنف والسماح لهم وضع الأجنة لمدة 1-2 ساعة، أو 3) اختيار L4 اليرقات من السكان المختلطة والانتقال إلى لوحة المصنف الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الديدان الخيطية في 20 ° C إلى مرحلة الشباب حامل، والتي سوف تأخذ ما يقرب من 96 ساعة من الفقس، 72 ساعة من اليرقات أو L1 24 ساعة تساقط L4 آخر. أجنة (2-20 خلية) في الرحم تحتوي على نواة كبيرة وblastomeres التي هي الأمثل لايماجالتغييرات جي الفرعية الخلوية وشبه النووية، على التوالي. هذه المنهجية توفر وسيلة لتوليد السكان البالغين الشباب التي تحتوي على وفرة عدد من الأجنة المبكرة. </li></ol> 2. تعيين إعداد الشرائح وغرفة نقص الأكسجين أعلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل غرفة الرطبة لعقد الشرائح المعدة من خلال وضع منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري كبير أو بن مغطاة غطاء حجم كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المنصهر الاغاروز 2٪ في O 2 H منزوع الأيونات عن طريق تسخين الخليط في الأواني الزجاجية عبر الميكروويف حمام أو ماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرات 1-3 من الاغاروز الحارة على شريحة زجاجية نظيفة المجهر. وضع على الفور الشريحة الثانية مقلوب عموديا على أعلى من انخفاض الاغاروز (ق)، واضغط قليلا حتى أن لوحة النتيجة سوف تكون رقيقة وخالية من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إتاحة الوقت لتبرد ببطء بعيدا واتخاذ الشرائح المجهر 2 ترك لوحة الاغاروز سليمة على واحد من الشرائح. من المهم لضمان الاغاروز لوحة رقيقة بما يكفي لعدم interfeمع إعادة القدرة على التركيز المجهر في وقت لاحق. القدرة على تصور نموذج يعتمد أيضا على المسافة الضوئية المحددة للهدف الاستخدام، التي يمكن أن تختلف بين المجاهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة نظيفة لتشكيل منصة الاغاروز في مربع صغير. تخزين في غرفة معدة للالرطبة حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة نفسه، اتخاذ حافة لوحة الاغاروز وتحويلها من الشريحة في الصعود إلى الدور ساترة 25 مم الدقيقة، وتجنب تراكم فقاعات الهواء تحت لوحة. وساترة الجولة المختارة لاستخدام بشكل مناسب في microincubator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من مخدر (0.5٪ tricaine، تتراميزول 0.05٪ في المخزن المؤقت M9) على منصة الاغاروز للاستخدام كمخدر. اختيار 5-10 والديدان مكان في قطرة من التخدير. تسمح دقيقة من 1-3 الديدان على وقف الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأساس المنطقي لمراقبة الأجنة داخل الرحم الكبار، بدلا من الأجنة تشريح، هو تقليل إمكانية desicca الجنيننشوئها والحركة بسبب تدفق غاز النيتروجين في جميع أنحاء الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة على الفور قطرة من النفط الهالوكربون على رأس الديدان لمنع الديدان من الجفاف كما هو تدفقت الغاز من خلال الغرفة. منذ النفط اللزج هو الهالوكربون يمكن للمرء استخدام الماصة أو تلميح غيض من دودة اختيار لجمع النفط وإسقاط على الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن ساترة دائرية تحتوي على الديدان مستعدة، أغلقت نصفي ليدن نضح يتم فصل microincubator، وساترة ومن ثم وضعت بعناية تستقيم على الحلبة أسفل. ثم يتم إغلاق الجانبين من الغرفة معا بإحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم توصيل الدائرة إلى النيتروجين الصهريج لنقل الغاز عبر أنابيب بلاستيكية مرنة، ووضع في المكان المناسب على المسرح المجهر (الشكل 1C). وينبغي في هذا الوقت أن الأنبوب وmicroincubator التحقق بعناية لأي تسرب من خلال ضمان مرفق آمن للأنابيب وميناء من المقابس على طول الجانب من الغرفة. يمكن للمرء ALحتى انتشرت طفيفة كمية صغيرة من الماء والصابون على أنابيب للبحث عن الفقاعات، التي ستشكل إذا تسرب موجودا. </li></ol> 3. المجهر نقص الأكسجين في <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع في أقل الحيوانات التكبير، ثم الانتقال إلى أعلى ملائمة للتضخم (64x لهذا التطبيق) إلى الأنسجة أو الخلايا صورة ذات الأهمية مثل blastomeres الجنينية أو البويضات لدى البالغين. بدوره على الليزر نانومتر 488 إلى عرض GFP إشارة وتحديد موقع GFP البروتين الانصهار في الخلية (ق) من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الاعتقال في مرحلة معينة من دورة الخلية القبض (على سبيل المثال الطور التمهيدي في وقت متأخر) تحديد قسيم أرومي في مرحلة سابقة من انقسام الخلايا (على سبيل المثال أو الطور البيني أواخر الطور التمهيدي في وقت مبكر). سوف علامات الخلوية مثل موقف مريكز، بدء التكثيف كروموسوم والموقع كروموسوم وجود أو عدم وجود الغلاف النووي تساعد في تحديد الخلية مرحلة دورة (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وperfused ثم غرفة مع غاز النيتروجين (99.999٪N 2، &lt;2 جزء في المليون O 2). في هذه الحالة نستخدم الضغط من 6 رطل، ولكن الضغط قد تحتاج إلى تعديل وتحسين اعتمادا على حجم كل microincubator وقطر الأنابيب في الاستخدام. يواصل رصد قسيم أرومي (ق) كما في النيتروجين يملأ الغرفة، وتعديل المستوى البؤري حسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذه المرحلة، بدأ الوقت الفاصل بين التصوير. ويجري التصوير لطالما كان ذلك ضروريا لالتقاط ظاهرة الاهتمام، في هذه الحالة القبض الطور التمهيدي والتحام الكروموسومات لغشاء النووية الداخلية. تؤخذ الصور مرة واحدة كل 10 ثانية لمدة لا تزيد مدة 30 دقيقة. ينبغي تعديل ترددات التقاط الصور والإعدادات مثل زيادة قوة الليزر وحسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن في الوقت الذي الأجنة الاستجابة للبيئة تختلف تبعا لنقص الأكسجين مرحلة دورة الخلية عند التعرض نقص الأكسجين. عادة نقص الأكسجين الناجم عن إلقاء القبض الطور التمهيدي يحدث في غضون 20-30 دقيقة من بداية تدفق الغاز النيتروجين. وقد لاحظنا نقص الأكسجين الناجم عن اعتقال خلية دورة occurring في 20 دقيقة &lt;. ويمكن الحصول على الصور خلال هذا الإطار الزمني، أو يمكن أن تكون معزولة في وقت لاحق صور معينة من الوقت الفاصل بين سلسلة. خيار آخر هو استخدام المجهر لتصور فيديو الفرعية الخلوية في هياكل الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاسترداد المستند من الدولة التي يسببها نقص الأكسجين القبض، يتم تشغيل والغاز قبالة يسمح للغرفة للعودة إلى normoxia عن طريق الانتشار أثناء تسجيل الوقت الفاصل بين سلسلة. استئناف تقدم دورة الخلية وتنزيل لأكثر من الكروموسومات يحدث عادة في غضون 5-20 دقيقة من تحويل غاز النيتروجين من. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أنه في تجارب منفصلة وضعت مؤشرا نقص الأكسجين، ريسازورين، في التدفق من خلال microchamber، وقد تقرر أن يصبح نقص الأكسجين غرفة في المتوسط ​​ما يقرب من 19 دقيقة بعد النيتروجين تدفق الغاز قد بدأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم معالجة الصور ومقاطع الفيديو باستخدام Imaris، J صورة فوتوشوب أو كويك تايم والمستوردة إلى للعرض. </li></ol>

<ol>
	<li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans.">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li><li>Padilla, P. A., Ladage, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation,+diapause+and+quiescence:+Arresting+the+cell+cycle+in+C.+elegans.">Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer.">Dauer.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Longevity and stress in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).</li><li>Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cytoplasmic+dynein+heavy+chain+in+Caenorhabditis+elegans+with+fast-acting+temperature-sensitive+mutations.">Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li><li>Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+sub-nuclear+changes+in+Caenorhabditis+elegans+embryos+exposed+to+brief,+intermediate+and+long-term+anoxia+to+analyze+anoxia-induced+cell+cycle+arrest.">Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest.</a> BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).</li><li>Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anoxia. , (2012).</li><li>Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPP-16/Nup50+function+and+CDK-1+inactivation+are+associated+with+anoxia-induced+prophase+arrest+in+Caenorhabditis+elegans.">NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+animation+in+C.+elegans+requires+the+spindle+checkpoint.">Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+and+making+of+the+nuclear+envelope.">Breaking and making of the nuclear envelope.</a> J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans.">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+are+protected+from+lethal+hypoxia+by+an+embryonic+diapause.">C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause.</a> Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الحرمان الأوكسجين ويعلق إحياء على الرغم من أن التعرض للحرمان الأكسجين الحاد يمكن أن تكون قاتلة لبعض الكائنات الحية، بعض الكائنات الحية قادرة على البقاء على قيد الحياة التعرض لنقص الأكسجين. في حالة C. ايليجانس، بقاء التعرض نقص...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف / معدات </td><td></td><td></td><td> تركيب </td></tr><tr><td> هيبوكلوريت حل </td><td></td><td></td><td> 0،7 ز KOH، 12 مل NaOCl 5٪، وجلب إلى 50 مل مع DDH 2 0 </td></tr><tr><td> M9 العازلة </td><td></td><td></td><td> 3 غ KH 2 PO 4 و 11 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل (1 M) MgSO 4 في 1 L O 2 DDH </td></tr><tr><td> الشرائح الزجاجية المجهر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;X1&quot; x1.0 مم </td></tr><tr><td> جولة صغيرة ساترة </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 72223-01 </td><td> 25 مم القطر </td></tr><tr><td> الهالوكربون النفط 700 </td><td> سيجما </td><td> H8898-100ML </td><td></td></tr><tr><td> مخدر </td><td></td><td></td><td> 0.5٪ tricصفحة Ain، تتراميزول 0.05٪ </td></tr><tr><td> ليدن مغلق الإرواء Microincubator </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td> UHP النيتروجين </td><td> Calgaz (إير ليكيد) </td><td></td><td> &gt; 99،9990٪ N 2 &lt;2 O 2 جزء في المليون </td></tr><tr><td> البلاستيك أنابيب </td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0،062 &quot;ID X 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td> مجهر متحد البؤر القرص الغزل </td><td> نظم McBain </td><td></td><td> زايس البصرية مقلوب المجهر، ونظام الإضاءة epifluorescence، CSU-10 الماسح الضوئي مبائر يوكوجاوا، هاماماتسو كاميرا CCD الإلكترون مضاعف. </td></tr></tbody></table>

use of time lapse microscopy to visualize anoxia-induced suspended animation in c. elegans embryos

وقد استخدم على نطاق واسع Caenorhabdits ايليجانس في دراسة مقاومة الإجهاد، والتي سهلت من الشفافية في مراحل الجنين والكبار فضلا عن توافر المسوخ الجينية والسلالات المحورة وراثيا معربا عن عدد لا يحصى من البروتينات الانصهار 1-4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض العمليات الحيوية مثل البروتينات انقسام الخلايا باستخدام مراسل fluorescently المسمى. ويمكن تيسير دراسة الانقسام من خلال استخدام الوقت الفاصل بين التجارب في مختلف النظم بما في ذلك الكائنات سليمة، وبالتالي في وقت مبكر C. هي مناسبة تماما ايليجانس الجنين لهذه الدراسة. المقدمة هنا هي تقنية التصوير التي في الجسم الحي الفرعية الخلوية الهياكل استجابة لنقص الأكسجين (99.999٪ N 2، &lt;جزء في المليون 2 O 2) الإجهاد من الممكن استخدام تدفق الغاز من خلال الإعداد بسيطة على المجهر رفيع المستوى. يتم استخدام غرفة microincubation بالتزامن مع تدفق غاز النيتروجين من خلال المجهر والقرص الغزل مبائرلخلق بيئة تسيطر عليها فيه ولا يمكن تصوير الحيوانات في الجسم الحي. باستخدام GFP الموسومة تويولين جاما وهيستون، يمكن رصد ديناميات واعتقال انقسام الخلايا قبل وأثناء وبعد التعرض للبيئة الأوكسجين المحرومين. نتائج هذه التقنية هي عالية الدقة والفيديو والصور المفصلة للهياكل الخلايا خلال blastomeres الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين.

C. ايليجانس الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين الحاد (نقص الأكسجين) قادرة على البقاء على قيد الحياة من خلال اعتقال العمليات البيولوجية بما في ذلك تطوير وانقسام الخلايا 7. يمكن رصد اعتقال نقص الأكسجين الناجم عن انقسام الخلايا، على المستوى دون الخلوي، وذلك باستخد...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos at JoVE.com

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

الموصوفة هنا هو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التقنية لهياكل شبه الخلوية الصورة في حيوانات تعرضت لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال غرفة microincubation جنبا إلى جنب مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب واضح ومباشر ومرنة بما يكفي لتناسب مجموعة متنوعة من المعلمات التجريبية ونظم النموذج.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

use-time-lapse-microscopy-to-visualize-anoxia-induced-suspended

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

11.5K Views.  University of North Texas. الموصوفة هنا هو في الجسم الحي التقنية لهياكل شبه الخلوية الصورة في حيوانات تعرضت لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال غرفة microincubation جنبا إلى جنب مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب واضح ومباشر ومرنة بما يكفي لتناسب مجموعة متنوعة من المعلم...

Video: Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...