نود أن نعترف بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R15 - 03 إلى GM065444 LB) وبرنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (KO). تمول بمنح جبهة الخلاص الوطني (DBI - 0923402) اقتناء المجهر LSM700 مبائر. نود أيضا أن نعترف المساعدة العامة وتعليقات مفيدة على المخطوطة من الدكتور اندي الذهبي. الفضل يعود للمجتمع الدولي بأسره ايليجانس جيم لتقاسم الموارد ، والبروتوكولات ، والأفكار.

<html> 1. الخيطية الثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على جيم المناسبة سلالة ايليجانس انواع معينة من مركز علم الوراثة ألبوم (CGC) ، أو من زميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الديدان الخيطية على لوحات أجار NGM المصنف مع العشب an البكتيرية OP50 (3). لتحليل نمو سلالات GFP عند 25 درجة مئوية ويوصى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من التجربة المجهري الخاص ، واختيار ما لا يقل عن 40 L4 اليرقات المصنفة على لوحات لوحات والمكان عند 25 درجة مئوية خلال الليل. وسوف تكون هذه الديدان الشباب للتجربة. </li></ol> 2. الحقن إذا كان من المستحسن أن يتم عرض مثل هياكل lysosomes أو الميتوكوندريا ، يمكن حقن صبغة الفلورسنت مع الكبار قبل التصور. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منصات حقن agarose المجفف. (ويمكن أن يتم هذا واحد لعدة أيام قبل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المنصهر agarose 2 ٪ في الماء. مع ماصة باستور وضع قطرات في الصعود إلى 2 ملم 22X54 ساترة. مكان آخر ساترة عبر الحكيم على رأس قطرة. من أجل تحقيق سمك السليم ، اضغط على أعلى ساترة قطرها حتى لوحة حوالي 1.5 سم. اسمحوا الجلوس لمدة 5-10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة العلوي. يذوى لوحة agarose بوضعه في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو السماح للجلوس على الفوق بين عشية وضحاها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Mitotracker أو حل Lysotracker. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وكيل الفلورية في مخزن البيض. نستخدم عادة التخفيف من 1:10 Mitotracker أو Lysotracker. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حقن الإبرة من الزجاج OD 1.2 الشعرية. سحب إبرة الحقن باستخدام مجتذب الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة Pastuer سحبت لملء الإبرة مرة أخرى مع الصبغة المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة مكان في الغرفة ، وعلى ضوء خالية حتى استخدام مرطب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل حقن : إعداد المجهر والإبرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة حقن جبل على جهاز الحقن. جهاز لدينا هو micromanipulator Narishige المباشرة التي شنت حملة على خشبة المسرح من TE200 نيكون المجهر المقلوب مجهزة قدرة التصوير مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب الإبرة إلى 1.2 ملم معرف متصلة منظم الضغط. ويمكن استخدام إما الهواء المضغوط أو النيتروجين كمصدر للضغوط الخارجية. ضبط منظم إلى 20-25 رطل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 وضع قطرات من الزيت المعدني الثقيل (النفط Parafin) على لوحة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان اللوحة على حقن المجهر وخفض الإبرة في النفط. الاختيار لجعل تدفق السوائل بحرية تأكد من الإبرة عندما يتم تطبيق الضغط. الضغط الحقن ومراعاة ما إذا كان السائل يتدفق من الإبرة. إن لم يكن ، وسوف تحتاج لكسر بلطف نهاية الإبرة. ويمكن تقسيم الإبرة من قبل القيادة برفق صوب قطعة صغيرة من كسر ساترة وضعت على منصة الحقن. بعد الإبرة يتدفق ، والانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 1 ساعة قبل عرض الأجنة ، ونقل الشاب البالغ الديدان في انخفاض اسعار النفط على منصة الحقن. تنفيذ هذا النقل باستخدام مجهر تشريح. استخدام الدودة السلكية اختيار البلاتين مع طرف وأشار لنقل الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب 3-10 الديدان بحيث أنهم يكذبون مباشرة على لوحة. للحقن ، فمن أسهل إذا تصطف الديدان حتى موازية لبعضها البعض ، وأقل قليلا من واحد طول الدودة إربا. بمجرد أن الديدان الموجودة على لوحة الحقن من المهم العمل بسرعة واستكمال عملية الحقن قبل الديدان يهلك من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ساترة مع الديدان على خشبة المسرح مجهر المجهر الحقن. التركيز في الجزء المركزي (السيساء) من الأنبوب القاصي الغدد التناسلية. ثم استخدم لنقل micromanipulator غيض من الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. التحرك أفقيا حتى المرحلة التي يتم ثقب الدودة بواسطة الإبرة. مرة واحدة في رأس الإبرة هو داخل السيساء ، والضغط على الغدد التناسلية ، والسماح لملء مع خليط صباغة. ضخ ذراعيه لجميع الغدد التناسلية الديدان على منصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، واستخدام الماصة باستور سحبت لتسليم حوالي 0.5 مل من مخزن للبيض الديدان. هذا وسوف تبقي منهم من يموتون من الجفاف والسماح لهم للتعافي من إجراء الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاسترداد الديدان لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الغرفة ، وعلى ضوء خالية من ترطيب. </li></ol></li></ol> 3. Agarose منصة للعرض الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المنصهر agarose 2 ٪ في مخزن البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الماصة باستور ، وطرح 3 قطرات من agarose المنصهر على شريحة المجهر نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة مكان بين اثنين من الشرائح الأخرى التي لديها طبقة واحدة من العلامات الشريط تغطيتها. هذه بمثابة الفواصل التي من شأنها ضمان بأن ما تتمتعون به agarose سادة هو سمك الصحيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المركز الثاني شريحة المجهر نظيفة أسفل عموديا على قطرات agarose. اضغط لأسفل حتى الشريحة العليا تقع على الشريط من الشرائح الدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل قليل كنت على استعداد لشن الأجنة لمراقبة وإزالة الشريحة العليا. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. تصاعد الأجنة للعرض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يتم حقن الديدان ، اتبع الخطوتين التاليتين. تخطي خلاف عليها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الديدان الشباب البالغين من لوحة التي تم إعدادها في اليوم السابق. يجب أن تكون قادرا على رؤية الجنين داخل البالغين الشبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 50-20 الديدان على لوحة NGM غير المصنف. السماح للديدان إلى الزحف نحو غير المصنف على لوحة لبضع دقائق حتى أن الديدان سوف تفقد معظم البكتيريا التي عالق لهم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أجنة صغار البالغين من الديدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان هبوط 50-20 ميكرولتر من الاحتياطي البيض في منتصف ساترة زجاج 18 مم 2 (سمك 1.5 ساترة هو الأفضل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الديدان من لوحة غير المصنف أو وسادة الحقن في قطرة من الاحتياطي البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الديدان مفتوحة مع إبرة تحت الجلد قياس 26. قطع مفتوحة الدودة قرب الفرج. سترى الأجنة تسرب من الدودة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على شريحة المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس الشريحة المجهر الذي أعد مع لوحة agarose والسفلى وضعها على ساترة مع الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تمديد الفترة الزمنية ، واستخدام الفازلين لختم حواف ساترة لمنع أصاب. </li></ol></li></ol> 5. المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على الأجنة المناسبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة مكان على الساحة المجهر. تفحص مع عدسة 10X للعثور على الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على الأجنة مرحلة مبكرة ، والبحث عن الأجنة التي هي في طور استكمال الانقسام الاختزالي الأمهات. ويمكن تمييز الأجنة الانتصافي من أجنة في وقت لاحق لأنهم لم يخضعوا لتقصير. (الأجنة بعد الانتهاء الانقسام الاختزالي ، يمكنك ان ترى وجود فجوة كبيرة بين غشاء الخلية وقشرة البيضة في نهاية الأمامي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذات مرة كنت قد رصدوا نظموا الجنين بشكل مناسب ، والانتقال إلى عدسة التكبير العالي لتسجيل مرحلة التطور الجنيني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذا المثال ، تخيل أننا الأجنة التي تعبر عن mCherry : H2B وGFP : UB الموسومة البروتينات. نحن نستخدم LSM700 زايس المسح بواسطة أشعة الليزر التقليدية المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع الصور باستخدام عدسة 1.4NA 63X. تستخدم أشعة الليزر 488 و 555 مع قوة الليزر وكسب الحد الأدنى من الحد الأقصى. يتم جمع كل ثانية من الالف الى الياء المكدس 10-15. اعتمادا على مدى photobleaching ، يتم جمع النقاط الزمنية 30-60. وانهار صور المكدس Z إلى صورة إسقاط الحد الأقصى للفيديو الوقت الفاصل النهائي. </li></ol></li></ol> 6. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التسميد على الانقسام الميتوزي الأولى في C. ايليجانس. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. Microinjection الداخلي. تكميلية الفيديو 1 التوقيت الفاصل الفيديو GFP :. اليوبيكويتين الأزرق زائد Lysotracker في جنين الانتصافي <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">انقر هنا لعرض الفيديو.</a>

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. (42), e2090-e2090 (2010).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenrohabditis+elegans.">The Genetics of Caenrohabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+WormBook.">Cell division WormBook.</a> , (2006).</li><li>McNally, K. L., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+initiates+the+transition+from+anaphase+I+to+metaphase+II+during+female+meiosis+in+C.+elegans.">Fertilization initiates the transition from anaphase I to metaphase II during female meiosis in C. elegans.</a> Dev Biol. 282, 218-230 (2005).</li><li>Sato, K., Sato, M., Audhya, A., Oegema, K., Schweinsberg, P., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+caveolin-1+trafficking+in+the+germ+line+and+embryo+of+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic regulation of caveolin-1 trafficking in the germ line and embryo of Caenorhabditis elegans.</a> Mol Biol Cell. 17, 3085-3094 (2006).</li><li>Stitzel, M. L., Pellettieri, J., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+DYRK+Kinase+MBK-2+Marks+Oocyte+Proteins+for+Degradation+in+Response+to+Meiotic+Maturation.">The C. elegans DYRK Kinase MBK-2 Marks Oocyte Proteins for Degradation in Response to Meiotic Maturation.</a> Curr Biol. 16, 56-62 (2006).</li><li>Schetter, A., Askjaer, P., Piano, F., Mattaj, I., Kemphues, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporins+NPP-1,+NPP-3,+NPP-4,+NPP-11+and+NPP-13+are+required+for+proper+spindle+orientation+in+C.+elegans.">Nucleoporins NPP-1, NPP-3, NPP-4, NPP-11 and NPP-13 are required for proper spindle orientation in C. elegans.</a> Dev. Biol. 289, 360-371 (2006).</li><li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans.">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1, (2001).</li><li>Badrinath, A. S., White, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+of+mitochondrial+redistribution+in+the+early+lineages+of+Caenorhabditis+elegans+and+Acrobeloides+sp.+PS1146.">Contrasting patterns of mitochondrial redistribution in the early lineages of Caenorhabditis elegans and Acrobeloides sp. PS1146.</a> Dev. Biol. 258, 270-275 (2003).</li><li>Johnston, W. L., Krizus, A., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+is+required+for+meiotic+fidelity,+polar-body+extrusion+and+polarization+of+the+C.+elegans+embryo.">The eggshell is required for meiotic fidelity, polar-body extrusion and polarization of the C. elegans embryo.</a> BMC Biol. 4, 35-35 (2006).</li><li>Parry, J. M., Velarde, N. V., Lefkovith, A. J., Zegarek, M. H., Hang, J. S., Ohm, J., Klancer, R., Maruyama, R., Druzhinina, M. K., Grant, B. D., Piano, F., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans.">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19, 1752-1757 (2009).</li><li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging.">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75, 2015-2024 (1998).</li><li>Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+and+multidimensional+analysis+of+cell+dynamics.">Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics.</a> Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بعد الاندماج مع الحيوانات المنوية ، واقحة يخضع لسلسلة من الفعاليات الحيوية. هذه الأحداث تحويل من خلية البويضة ثابتة نسبيا في الجنين النامي بسرعة. في كثير من الكائنات ، إعادة ترتيب هيولي حاسمة لتحديد قطبية الجنينية وتنشيط البويضة. وجيم ايليجانس الجنين يوفر فرصة ممتازة لمراقبة هذه الأحداث في وقت مبكر من تنشيط البويضة وتكوين الجنين. الجنين شفافة وتحدث أحداث التنموية في وقت مبكر نسبيا بسرعة بعد الإخصاب. جيم وقد ولدت كثير من الباحثين ايليجانس السلالات المعدلة وراثيا مفيدة تعبر عن fluorescently البروتينات المسماة العاملة في مجال التنمية في وقت مبكر. باستخدام هذه السلالات مع رني المسوخ أو نظاما قويا للتشريح المسارات الجزيئية التي تكمن وراء تطور الكائن متعددة الخلايا (5 ، 6 ، 7 ، 8). هذا المقال يعرض الفيديو نهجا عمليا لاستخدام هذه الأدوات والتقنيات اللازمة لتسجيل الأحداث خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر في C. ايليجانس. وجيم ناضجة تم القبض ايليجانس البويضة في الطور الأول من الانقسام المنصف وأنا المخصبة في spermatheca للخنثى الكبار. بعد الإخصاب ، البويضة العائدات خلال الفترة المتبقية من الانقسام الاختزالي الأول والثاني. ويمكن ملاحظة هذه المراحل باستخدام H2B هيستون fluorescently المسمى (5). أثناء الانتهاء من الانقسام الاختزالي الأمهات ، والحمض النووي الحيوانات المنوية لا تزال مكثف (انظر الشكل 1). بعد الانتهاء من الانقسام المنصف ، والحمض النووي الأم والأب ويصبح decondensed شكل pronuclei اثنين. في طليعة النواة الأم بترحيل نحو طليعة النواة الأب وينضمون معا بالقرب من مركز للجنين. الانقسام بسرعة بعد الاجتماع تستتبعه pronuclear. كل هذه الأحداث تحدث في أقل من ساعة. وبالتالي ، يمكن أن يكون الوقت الفاصل بين المجهري من هذه السلسلة من الأحداث إنجازه بسهولة. تنفيذ هذا الاسلوب يتطلب منشأة معينة في زراعة الخيطية فضلا عن المهارات الأساسية في الفحص المجهري بالإضافة إلى الوصول إلى مبائر المجهر. المثال المعروض هنا يستخدم لجيم المعدلة وراثيا ايليجانس السلالة التي تعبر عن اثنين من البروتينات الفلورية ، GFP : اليوبيكويتين وmCherry : H2B. ويستخدم الليزر مبائر المسح المجهر لمراقبة توطين دينامية هذه البروتينات اثنين. بالإضافة إلى ذلك ، أن نظهر أنه يمكن استخدام حقن Lysotracker fluorescently المسمى لمتابعة مصير lysosomes في الجنين بعد الإخصاب. ويمكن أيضا حقن تعقب المسمى أن يؤديها لتركيزات الكالسيوم التصور الميتوكوندريا أو المحلية (9). من الناحية النظرية ، يمكن أن تستخدم بروتوكول الحقن لعرض أي نوع من جزيء fluorescently المسمى في الجنين. قد تتضمن هذه الجزيئات الصغيرة المسماة ، والبروتينات ، والدهون ، وما إلى ذلك وفي بعض الحالات ، قد لا يكون من الضروري ضخ فعلا بتتبع الديدان وصفت بأنها سوف يسهل امتصاص بعض الصبغات مثل mitotracker (10). ومع ذلك ، حاولنا كل من تمرغ وحقن lysotracker وجدت نتائج أفضل بكثير مع حقن للأجنة في التصور. التقنية اعتبارات : التحديات التقنية التي قدمت لهذا الإجراء تشمل تقنية microinjection فضلا عن صعوبة التصوير في الأجنة في وقت مبكر جدا. فيما يتعلق microinjections ، سمك لوحة حقن agarose هو أمر حاسم لنجاح الحقن. إذا لوحة سميكا جدا ، فإن الديدان dessicate ويموت بسرعة. إذا لوحة رقيقة جدا ، فإن الديدان لا عصا الى منصة أثناء عملية الحقن. يمكن للأجنة مبكرة تكون حساسة للظروف البيئية مثل درجة الحرارة والظروف العازلة. وينبغي الشروع في الأجنة البرية decondensation نوع من الحيوانات المنوية والحمض النووي pronuclear الهجرة في غضون دقيقة أو نحو ذلك من استكمال الانقسام الاختزالي الثاني (4). في غضون 20 دقيقة ، وينبغي أن تبدأ أول الحرائك الخلوية. إذا تعرضت الأجنة ليزر كثافة عالية جدا أو الساخنة أو يتم سحقها خلال تصاعد ، قد يتم تعطيل هذه العملية. ومثل هذه الأجنة اعتقال التنمية. إذا حدث هذا ، ينبغي تكرار هذه التجربة مع انخفاض قوة الليزر أو لوحة agarose سمكا. جيم ايليجانس الأجنة لا تفرز قذيفة من البيض حتى بعد فترة قصيرة من الإخصاب. خلال فترة زمنية قصيرة بين التسميد وإفراز من قشرة البيضة والأجنة ليست قابلة للحياة خارج للأم (11). تجنبت بعض المعامل هذا التحدي من خلال تصوير الأجنة في الرحم (5 ، 12). التصوير في الرحم يوفر مزايا معينة مثل القدرة على التقاط الأحداث التي تحدث أثناء أو بعد مرور الإخصاب. ومع ذلك ، هذا الأسلوب يتطلب استخدام نظام الفحص المجهري الذي يسمح لتصوير الأنسجة العميقة. هي مناسبة خاصة مثل أنظمة الفوتون اثنين أو متعدد الفوتون ، لهذا (13 ، 14). عند استخدام الليزر التقليدية أو مسح القرص مبائر الغزل المجهر ، ويتم الحصول على أفضل الصور التي هكتار من أجنةلقد تم قصها من الدودة كما هو موضح هنا. التصوير اعتبارات النظام : نوع نظام التصوير المستخدمة مبائر يتوقف احتياجات المستخدمين. عموما ، ينصح الليزر أنظمة المسح الضوئي إذا كان أحد يرغب في الحصول على صور ذات أعلى دقة ممكنة. من ناحية أخرى ، هي أكثر ملاءمة نظم القرص الغزل لعمليات التصوير وديناميكية للغاية الحصول على الصور سريعا نسبيا وانخفاض photobleaching / الضيائية. سوف المعلمات التصوير محددة تختلف تبعا لتصميم التجارب ونظام التصوير مبائر العاملين. في مجال التصوير متعدد الأبعاد ، ويحتاج المرء للنظر في عدد من القنوات ، والطائرات التنسيق ، والوقت يجري جمع نقاط. يرجع ذلك إلى الحد من الآثار photobleaching والضيائية ، يمكن الحصول على عدد محدود من الصور في أي تجربة معينة. وبالتالي ، إذا اخترت لزيادة عدد القنوات التي سيتم شراؤها ، وسوف تحتاج على الأرجح إلى خفض عدد طائرات التنسيق و / أو نقاط الوقت والعكس بالعكس. وسوف يتأثر إجمالي عدد الصور التي يمكن الحصول عليها من شدة fluorophore التي يجري تصويرها ، وكذلك حساسية المجهر مبائر المستخدمة. سوف fluorophores أكثر كثافة وأكثر حساسية تتطلب الصكوك أقصر الأوقات التعرض وبالتالي تنتج أقل photobleaching والضيائية. وهناك عدد كبير أو نظم التصوير المتوفرة. وسوف نعطي تفاصيل عن الأنظمة التي تم استخدامها في المختبرات الخاصة بنا. لأجنة دودة بواسطة التصوير المجهري القرص مبائر الغزل ، ونحن استخدام المجهر المقلوب TE2000U نيكون مجهزة 60X/1.4 NA خطة موضوعية آبو. توصيل وحدة المجهر لCSU10 يوكوجاوا القرص الغزل وهاماماتسو C9100 - 13 EM كاميرا CCD ، والبحوث التطبيقية الطيفي LMM5 حدة نمطية دمج ليزر يحتوي على أربعة أجهزة الليزر في الحالة الصلبة مع الانتاج بنحو 405 ، 491 ، 561 و 655 نانومتر. باستخدام هذا النظام يمكن أن نستولي على واحدة أو قناتين ، 6-12 طائرات التنسيق ، و25-50 timepoints (في فترات 30-60 الثانية). زمن التعرض نموذجية من 100 إلى 200 ميلي ثانية. لأجنة التصوير مع ليزر متحد البؤر المجهر ، نستخدم زايس LSM700 مجهزة 2 وأربع قنوات ليزر الحالة الصلبة (405 ، 488 ، 555 ، 635 نانومتر و). ويرد هذا النظام إلى المراقب زايس مجهر مقلوب محوري مع خطة آبو الهدف 63X/1.4NA تستخدم لتصوير الجنين. يستخدم النظام برنامج زايس ZEN لاقتناء الصور التي تقدم أيضا محدودة ومعالجة الصور وتحليلها. عند التصوير مع اثنين fluorochromes ، ونحن نجتمع عادة طائرات التنسيق 1-5 (~ 0.5 ميكرومتر وبصرف النظر) وجمع كومة Z كل 15 ثانية. واصلت مجموعة كبيرة حتى photobleaching حدث. لإنشاء النهائي الوقت الفاصل الفيديو ، يتم دمج الصور المكدس Z باستخدام أداة الإسقاط القصوى في برنامج ZEN. يتم تصديرها من برنامج الفيديو كملفات افي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تركيب </th></tr><tr><td> البيض العازلة </td><td></td><td></td><td> 5mM Hepes الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 110mM كلوريد الصوديوم ، 4mM بوكل ، المغنيسيوم خلات 5mm ، و CaCl 5mM 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M - 7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L - 7525 </td><td></td></tr><tr><td> الماصة حقن شعرية </td><td> جهاز هارفارد ، كينت ، المملكة المتحدة </td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td> إبرة بولير </td><td> Kopf </td><td> نموذج 700C </td><td></td></tr><tr><td> جهاز Microinjector </td><td> Tritech بحوث </td><td> MINJ - 1 المنظم microinjection </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

ايليجانس انواع معينة وغالبا ما تستخدم نظام نموذجي في الدراسات التنموية من العمليات في وقت مبكر. الشفافية في الأجنة ، والموارد الجينية ، والسهولة النسبية للتحول هي الصفات التي تجعل C. ايليجانس نموذجا ممتازا لمرحلة التطور الجنيني المبكر. القائم على الليزر والمجهر مبائر به fluorescently المسمى تسمح للباحثين لمتابعة هياكل محددة والبروتينات الخلوية في الأجنة النامية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء متابعة العضيات محددة ، مثل lysosomes أو الميتوكوندريا ، وذلك باستخدام الأصباغ fluorescently المسمى. يمكن أن يتم تسليم هذه الأصباغ على الجنين في وقت مبكر عن طريق microinjection في الغدد التناسلية الكبار. أيضا ، يمكن أن يتبع توطين بروتينات معينة باستخدام بروتين فلوري به. وتعرض الأمثلة التي تبين هنا استخدام صبغة الفلورسنت الليزوزومية فضلا الموسومة fluorescently البروتينات هيستون واليوبيكويتين. يتم استخدام المسمى هيستون لتصور الحمض النووي ، وبالتالي تحديد مرحلة من مراحل دورة الخلية. GFP الموسومة اليوبيكويتين يكشف عن ديناميات حويصلات ubiquitinated في الجنين في وقت مبكر. يمكن استخدامها لتحديد ما إذا اليوبيكويتين هناك colocalization بين الحويصلات ubiquitinated وlysosomes : ملاحظات lysosomes وصفت وGFP :. وتقدم تقنية لmicroinjection الصبغة الليزوزومية. وتعرض تقنيات لتوليد سلالات transgenenic في مكان آخر (1 ، 2). التصوير ، ويتم قطع أجنة من الديدان الخيطية خنثى الكبار وعلى منصات محمولة على agarose 2 ٪ تليها الوقت الفاصل بين المجهري على الليزر القياسية أو المسح المجهر متحد البؤر المجهر القرص الغزل مبائر. هذه المنهجية ينص على التصور وارتفاع القرار من مرحلة التطور الجنيني المبكر.

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في الخيطية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt;.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.9K Views.  University of Alabama in Huntsville. توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في الخيطية انواع معينة ايليجانس.

Video: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

رصد أكتين التفكيك مع مرور الزمن الميكروسكوب

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الأجنة

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

التصوير الخالي من التسميات لديناميكيات تخزين الدهون في Elegans Caenorhabditis باستخدام المجهر التشتت رامان المحفزة

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video