تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM128873 ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية 2045493 (منحت ل M.N.M.). ميغان نيكول ماكلين ، دكتوراه حاصلة على جائزة مهنية في الواجهة العلمية من صندوق بوروز ويلكوم. تم دعم ZPH من خلال منحة تدريب NHGRI لبرنامج التدريب على علوم الجينوم 5T32HG002760. نحن نقدر المناقشات المثمرة مع أعضاء مختبر ماكلين ، وعلى وجه الخصوص ، نحن ممتنون لكيران سويني لتقديم تعليقات على المخطوطة.

تم توثيق سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. تظهر هذه السلالات نموا قويا في نطاق درجة الحرارة من 22 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية ويمكن زراعتها في مختلف وسائط الخميرة القياسية.
1. إعداد محطة عمل الأتمتة
<ol><li>جهز محطة العمل الآلية بذراع قابض روبوتي (RGA ، انظر جدول المواد) قادر على تحريك ألواح microwell (الشكل 1).</li>
	<li>قم بتركيب شاكر سخان الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد) في محطة العمل الآلية (الشكل 1 (1)) باستخدام آلية قفل اللوحة التلقائية التي توفر الوصول إلى RGA.</li>
	<li>ضع قارئ الألواح الدقيقة بجوار محطة العمل الآلية (الشكل 1 (2)) ، مما يضمن إمكانية الوصول إلى RGA.</li>
	<li>قم بدمج جهاز إضاءة microplate (الشكل 1 (3)) الذي يسمح بالوصول المريح إلى RGA. ومن الأمثلة على ذلك لوحة البصر8 (كما هي مستخدمة في هذه الدراسة) أو LITOS9 (انظر جدول المواد).</li>
</ol>2. إعداد جهاز الإضاءة
<ol><li>قم ببناء ومعايرة لوحة البصر (أو جهاز الإضاءة البديل) باتباع الطرق المعمول بها8،10،11.</li>
	<li>استخدم محولا على جهاز الإضاءة لتمكين الوصول إلى RGA.</li>
	<li>قم ببرمجة optoPlate باستخدام إدخال جدول بيانات10 أو واجهة رسومية12. اتبع الخطوة 3 لتنفيذ برامج تحفيز الضوء.</li>
</ol>3. تصميم برنامج التحفيز الضوئي
<ol><li>حدد ظروف الإضاءة المطلوبة للتجربة.</li>
	<li>أدخل ظروف الإضاءة المطلوبة، بما في ذلك شدة الضوء ووقت بدء الضوء وطول النبضة ورقم النبضة ومدة النبضة البينية في جدول بيانات. ملاحظة: قم بتحديث هذه المعلومات على لوحة البصر باستخدام الإرشادات المتوفرة في مستودع GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. تذكر أن لوحة العينة لن تضيء أثناء وجودها في قارئ الصفيحة الدقيقة أو على شاكر السخان. قد تتطلب مدة وتواتر هذه الأحداث التحسين بناء على متطلبات تجريبية محددة.</li>
	<li>قم بتضمين الظروف المظلمة لكل سلالة لتمكين قياسات الخلفية المناسبة.</li>
	<li>لتجارب التوصيف الأولية لتقييم وظائف التحويل ، استخدم شدة ضوء عالية. ملاحظة: يجب تحسين شدة الضوء لإجراء تجارب أكثر حساسية ، حيث يمكن أن يكون الضوء الزائد ساما للضوء للخميرة13.</li>
</ol>4. إعداد قارئ الصفائح الدقيقة
<ol><li>قم بتكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس الكمية المطلوبة من الاهتمام قبل إجراء التجارب. ملاحظة: في هذا المثال ، تم تكوين قارئ الصفائح الدقيقة لقياس التألق من مراسل يعبر عنه إجهاد الاهتمام. يمكن استخدام مخرجات أخرى ، مثل التلألؤ أو الكثافة الضوئية ، اعتمادا على المتطلبات التجريبية.</li>
	<li>قم بزراعة سلالة الاهتمام (جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم غير فلوري) في الوسائط الاصطناعية الكاملة (SC)14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى) (انظر جدول المواد) إلى أعلى كثافة خلية ليتم قياسها. انقل الثقافات إلى لوحة ميكروويل ذات قاع زجاجي أسود الجدران (انظر جدول المواد) وقم بقياسها لتحديد إعدادات قارئ الصفائح الدقيقة المثلى. ملاحظة: تأكد من قراءات دقيقة عن طريق إدخال أبعاد اللوحة بشكل صحيح وقياس اللوحة من الأسفل.</li>
	<li>الرجوع إلى قاعدة بيانات البروتين الفلوري (على سبيل المثال ، fpbase.org) للحصول على أطياف الامتصاص والانبعاث التقريبية للبروتين الفلوريالمستهدف 15.</li>
	<li>حدد قيمة z (المسافة بين اللوحة والقارئ) عن طريق إجراء مسح z على الآبار التي تحتوي على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت. حدد قيمة z التي تنتج أعلى نسبة إشارة إلى ضوضاء.</li>
	<li>تحسين أطياف الامتصاص والانبعاث عن طريق إجراء عمليات مسح الامتصاص والانبعاث على سلالات الفلورسنت وغير الفلورسنت لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى.</li>
	<li>قم بقياس إجهاد الفلورسنت مع ضبط الكسب على المستوى الأمثل ، وتحديد أعلى كسب بصري يمكن استخدامه دون التسبب في خطأ في قياس الفائض. ملاحظة: يجب ضبط هذا الكسب البصري يدويا بشكل متسق عبر التجارب التي تتضمن نفس الإجهاد لضمان اتساق النتائج.</li>
	<li>قم بإعداد برنامج نصي للقياس (راجع الشكل 2) في برنامج قارئ الألواح الدقيقة. يقوم هذا البرنامج النصي بتكوين الأداة لقياس الكثافة الضوئية للمزارع والأطياف الفلورية لأي بروتينات فلورية ليتم قياسها. ملاحظة: قم بقياس الكثافة البصرية للسلالات عند 600 نانومتر ما لم تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء. بالنسبة للسلالات التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء ، قم بقياس الكثافة البصرية عند 700 نانومتر لتجنب التحيز16.</li>
	<li>اضبط البرنامج النصي للقياس للحفاظ على درجة حرارة حضانة داخلية تبلغ 30 درجة مئوية أثناء القياسات.</li>
	<li>قم بتكوين البرنامج النصي للقياس لتصدير البيانات إلى جدول بيانات أو ملفات ASCII ، وفقا للتفضيل.</li>
</ol>5. برمجة الروبوت
<ol><li>قم بتكوين تعريف طاولة العمل في برنامج محطة العمل الآلي بناء على التخطيط المادي للناقلات (على سبيل المثال ، هزازات السخان ، ومنصات العش ، وأجهزة الإضاءة) وأدوات المختبر (أي لوحة 96 بئرا) (انظر جدول المواد). قم بإنشاء برنامج نصي في برنامج محطة عمل الأتمتة لتنفيذ تحريض الضوء والقياسات (الشكل 3) ، باتباع الخطوات التالية.</li>
	<li>قم بتعطيل أي مصادر إضاءة داخلية لمنع تنشيط الخلفية للأنظمة البصرية الوراثية.</li>
	<li>اضبط شاكر السخان للحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية. عندما لا تكون اللوحة على شاكر السخان ، ستكون في درجة الحرارة المحيطة (22 درجة مئوية).</li>
	<li>استخدم الحلقات والمؤقت ومتغير عد الحلقة لتكرار خطوات تحفيز الخلايا وقياسها على فترات منتظمة.</li>
	<li>قبل تسجيل القياسات ، هز لوحة العينة لضمان التعليق المناسب لجميع الخلايا. اهتزاز 60 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة مع مدار 2 مم يكفي بشكل عام لإعادة تعليق خلايا S288C S. cerevisiae وتجنب تحيز القياس.</li>
	<li>انقل لوحة العينة إلى قارئ الصفيحة الدقيقة باستخدام ذراع الروبوت وقم بإزالة الغطاء (إن أمكن) لمنع التحيز في قياس الكثافة البصرية. سيقوم برنامج التحكم تلقائيا بإزالة الغطاء واستبداله إلى الموضع المحدد إذا تم ضبط تعريف حامل قارئ الصفيحة الدقيقة على عدم السماح بالغطاء.</li>
	<li>قم بتنفيذ البرنامج النصي لقياس قارئ الصفائح الدقيقة كما هو موضح في الخطوة 4.</li>
	<li>استبدل الغطاء الموجود على لوحة العينة وانقل اللوحة إلى جهاز الإضاءة باستخدام ذراع الروبوت.</li>
	<li>اضبط البرنامج النصي على الانتظار حتى يصل المؤقت إلى الفاصل الزمني المحدد (على سبيل المثال ، 30 دقيقة مضروبة في متغير عد الحلقة) ثم كرر الحلقة بأكملها للعدد المطلوب من التكرارات (على سبيل المثال ، 48 مرة لتجربة 24 ساعة).</li>
	<li>استكشاف الأخطاء المحتملة وإصلاحها وضمان الأداء السليم لتعريفات الناقل والأدوات المعملية ، بالإضافة إلى قدرة RGA على التقاط اللوحة ووضعها بدقة عن طريق تشغيل لوحة فارغة عبر حلقة البرنامج النصي عدة مرات.</li>
	<li>قم بتكوين تنبيهات المستخدم لإعلام المستخدم بأي تغييرات أو أخطاء في حالة الأداة قد تحدث أثناء تنفيذ البروتوكول.</li>
</ol>6. إعداد لوحة العينة
<ol><li>تنمو سلالات الخميرة على ألواح الوسائط الغنية ، مثل YPD agar17 (انظر جدول المواد). قم بتضمين عنصر تحكم غير فلوري (سلبي).</li>
	<li>حدد المستعمرات من الألواح وقم بتلقيحها في 3 مل من وسائط SC14 (أو وسائط مضان منخفضة أخرى ، مثل LFM18) في أنابيب الثقافة الزجاجية. احتضان الثقافات طوال الليل عند 30 درجة مئوية على أسطوانة دوارة مع إبقائها في الظلام أو في ظل ظروف الإضاءة غير المستجيبة (على سبيل المثال ، الضوء الأحمر للأنظمة المستجيبة للضوء الأزرق).</li>
	<li>قم بقياس الكثافة البصرية للمزارع الليلية عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من كل مزرعة إلى 1 مل من وسائط SC وتسجيل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الصفيحة الدقيقة.</li>
	<li>تمييع كل ثقافة بين عشية وضحاها إلىOD 600 من 0.1 في أنابيب الثقافة الزجاجية. لاختبار إجهاد الإنتاجية الأعلى ، قم بإجراء التخفيفات الآلية في ألواح microwell.</li>
	<li>ماصة الثقافات المخففة في لوحة 96 بئرا. قم بتضمين الآبار الثلاثية لكل حالة (أي ثلاثة آبار متطابقة بنفس السلالة وحالة الضوء) لمراعاة التباين الفني. قم بتضمين الآبار ذات الوسائط الفارغة والخلايا غير الفلورية كعناصر تحكم سلبية لقياس مضان الخلفية والكثافة البصرية.</li>
	<li>احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 5 ساعات قبل البدء في تجربة الحث الضوئي. اضبط كميات التخفيف وأوقات الحضانة حسب الضرورة لتحسين سلالات وظروف تجريبية محددة.</li>
</ol>7. إجراء التجربة
<ol><li>ضع لوحة العينة على شاكر السخان وابدأ البرنامج النصي للأتمتة كما هو موضح في الخطوة 5.</li>
	<li>ابدأ برنامج تحفيز الضوء كما هو موضح في الخطوة 3 بمجرد تسجيل القياس الأولي على قارئ اللوحة.</li>
	<li>إذا لم تكن محطة عمل الأتمتة في غرفة مظلمة ، فقم بتغطيتها بستارة معتمة لتجنب إضاءة الخلفية.</li>
</ol>8. تحليل البيانات
<ol><li>قم بإنشاء خريطة جدول بيانات للتجربة ، تعكس تخطيط 8 × 12 للوحة 96 بئرا. تأكد من أن الخريطة تتضمن أسماء السلالات التي يتم قياسها في شبكة واحدة وأوصاف ظروف الإضاءة المستخدمة في شبكة أخرى.</li>
	<li>استخدم برنامج Python النصي أو لغة برمجة مفضلة أخرى لتحليل البيانات المصدرة. قم باستيراد جدول بيانات الخريطة إلى صفيف ، مع ربط أسماء السلالات وأسماء الشروط بكل بئر من اللوحة. ملاحظة: يمكن العثور على نموذج التعليمات البرمجية للتحليل على: https://github.com/mccleanlab/Lustro. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تطبيق لتحليل البيانات من قارئات اللوحات المختلفة19.</li>
	<li>اقرأ البيانات من جدول بيانات التجربة المصدر إلى صفيف آخر.</li>
	<li>قم بإنشاء مخططات لقيم الكثافة الضوئية وقيم التألق لكل سلالة وحالة بمرور الوقت ، كما هو موضح في الشكل 4.</li>
	<li>فحص مخططات الكثافة الضوئية لتحديد مراحل النمو الأسي أو التشبع في الثقافات. ستساعد هذه المعلومات في اختيار النقاط الزمنية المناسبة لمقارنة قياسات التألق بين السلالات أو الظروف ، كما هو موضح في الشكل 5.</li>
</ol>

تحليل استجابة الخميرة البصرية باستخدام تقنية أتمتة Lustro

<ol>
	<li>P&#233;rez, A. L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+strategies+for+the+control+of+gene+expression+in+yeasts.">Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts.</a> Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).</li><li>Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+for+transcriptional+programming+and+genetic+engineering.">Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering.</a> Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).</li><li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology.">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).</li><li>Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+in+vitro+and+in+vivo+Activities+of+Light+Inducible+Dimers:+a+Cellular+Optogenetics+Guide.">Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).</li><li>Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+signal+generators:+integrating+synthetic+biology+tools+and+in+silico+control.">Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control.</a> Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).</li><li>Harmer, Z. P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lustro:+High-throughput+optogenetic+experiments+enabled+by+automation+and+a+yeast+optogenetic+toolkit.">Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit.</a> ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates.">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li><li>H&#246;hener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LITOS:+a+versatile+LED+illumination+tool+for+optogenetic+stimulation.">LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation.</a> Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).</li><li>Gr&#248;dem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+calibration+of+optoPlate+LEDs+to+reduce+light+dose+variation+in+optogenetic+experiments.">Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments.</a> BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).</li><li>Dunlop, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).</li><li>Thomas, O. S., H&#246;rner, M., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+graphical+user+interface+to+design+high-throughput+optogenetic+experiments+with+the+optoPlate-96.">A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96.</a> Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).</li><li>Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light+alters+yeast+metabolic+rhythms+by+inhibiting+respiration.">Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Complete+(SC)+Medium.">Synthetic Complete (SC) Medium.</a> 2016 (11), (2016).</li><li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPbase:+a+community-editable+fluorescent+protein+database.">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li><li>Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+wavelengths+collide:+bias+in+cell+abundance+measurements+due+to+expressed+fluorescent+proteins.">When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YPD+media.">YPD media.</a> 2010 (9), (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).</li><li>Csibra, E., Stan, G. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parsley:+a+web+app+for+parsing+data+from+plate+readers.">Parsley: a web app for parsing data from plate readers.</a> Zenodo. , (2023).</li><li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology.">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).</li><li>Guti&#233;rrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cybergenetic+control+of+bacterial+co-culture+composition+via+optogenetic+feedback.">Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback.</a> Nature Communications. 13, 4808 (2022).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7, 12546 (2016).</li><li>Bertaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+bioreactor+arrays+for+automated+measurements+and+reactive+control+with+ReacSight.">Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight.</a> Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).</li><li>Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+closed-loop+feedback+control+of+the+unfolded+protein+response+optimizes+protein+production.">Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production.</a> Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).</li><li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures.">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).</li><li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feedback-enabled+optogenetic+stimulation+and+spectroscopy+in+microwell+plates.">High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Pouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+beta-carotene+bioproduction+in+yeast+across+multiple+lab-scales.">Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).</li><li>Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+optogenetics+for+bioproduction:+dynamic+control+strategies+and+scale-up+instruments.">The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments.</a> Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يعمل بروتوكول Lustro المعروض هنا على أتمتة عمليات الزراعة والإضاءة والقياس ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصرياتالوراثية 6. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج جهاز الإضاءة وقارئ الألواح الدقيقة وجهاز الاهتزاز في محطة عمل الأتمتة. يوضح هذا البروتوكول على وجه التحديد فائد?...

علم البصريات الوراثي هو تقنية قوية تستخدم البروتينات الحساسة للضوء للتحكم في سلوك الخلايا بدقةعالية 1،2،3. ومع ذلك ، فإن النماذج الأولية للتركيبات الوراثية البصرية وتحديد ظروف الإضاءة المثلى يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تحسين أنظمة البصرياتالوراثية 4,5. يمكن للطرق عالية الإنتاجية لفحص وتوصيف نشاط الأنظمة الوراثية البصرية بسرعة تسريع دورة اختبار التصميم والبناء لاختبار تركيبات النماذج الأولية واستكشاف وظيفتها.
تم تطوير منصة Lustro كتقنية أتمتة للمختبرات مصممة لفحص وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية عالية الإنتاجية. إنه يدمج قارئ الصفائح الدقيقة وجهاز الإضاءة وجهاز الاهتزاز مع محطة عمل الأتمتة6. يجمع Lustro بين الزراعة الآلية والتحفيز الضوئي للخلايا في ألواح microwell (الشكل 1 والشكل التكميلي 1) ، مما يتيح الفحص والمقارنة السريعة لأنظمة البصريات الوراثية المختلفة. منصة Lustro قابلة للتكيف بدرجة كبيرة ويمكن تعميمها للعمل مع روبوتات أتمتة المختبرات الأخرى ، وأجهزة الإضاءة ، وقارئات الألواح ، وأنواع الخلايا ، وأنظمة علم البصريات الوراثية ، بما في ذلك تلك التي تستجيب لأطوال موجية مختلفة من الضوء.
يوضح هذا البروتوكول إعداد واستخدام Lustro لتوصيف نظام البصريات الوراثي. يستخدم التحكم البصري الوراثي لعوامل النسخ المنقسمة في الخميرة كمثال على النظام لتوضيح وظيفة وفائدة المنصة من خلال التحقيق في العلاقة بين مدخلات الضوء والتعبير عن جين مراسل الفلورسنت ، mScarlet-I7. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين تبسيط تحسين أنظمة البصريات الوراثية وتسريع اكتشاف استراتيجيات جديدة للتحكم الديناميكي في الأنظمة البيولوجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plate with&#160; #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P96-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioShake 3000-T elm (heater shaker)</td>
			<td>QINSTRUMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluent Automation Workstation</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LITOS (alternative illumination device)</td>
			<td>Hohener, et al. Scientific Reports. 2022</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optoPlate-96 (illumination device)</td>
			<td>Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic Gripper Arm</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers &#8211; eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark (plate reader)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete media</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Connect (user alert app)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1734 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1763 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yMM1765 (BY4741 Mat&#945; ura3&#916;0::5&#39; Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3&#39; homology&#160; his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)</td>
			<td>Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Agar</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optogenetics experiments in yeast using the automated platform lustro

يوفر علم البصريات الوراثي تحكما دقيقا في السلوك الخلوي من خلال استخدام البروتينات الحساسة للضوء المشفرة وراثيا. ومع ذلك ، فإن تحسين هذه الأنظمة لتحقيق الوظيفة المطلوبة غالبا ما يتطلب دورات متعددة لاختبار التصميم والبناء ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. ولمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير منصة لوسترو، وهي منصة تجمع بين التحفيز الضوئي وأتمتة المختبرات، مما يتيح الفحص الفعال عالي الإنتاجية وتوصيف أنظمة البصريات الوراثية.
تستخدم Lustro محطة عمل أتمتة مزودة بجهاز إضاءة وجهاز اهتزاز وقارئ ألواح. من خلال استخدام ذراع روبوتية ، يقوم Lustro بأتمتة حركة لوحة microwell بين هذه الأجهزة ، مما يسمح بتحفيز سلالات البصريات الجينية وقياس استجابتها. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا حول استخدام Lustro لتوصيف أنظمة البصريات الوراثية للتحكم في التعبير الجيني في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae. يغطي البروتوكول إعداد مكونات Lustro ، بما في ذلك دمج جهاز الإضاءة مع محطة عمل الأتمتة. كما يوفر تعليمات مفصلة لبرمجة جهاز الإضاءة وقارئ اللوحات والروبوت ، مما يضمن التشغيل السلس والحصول على البيانات طوال العملية التجريبية.

Optogenetics is a powerful technique that utilizes light-sensitive proteins to control the behavior of cells with high precision1,2,3. However, prototyping optogenetic constructs and identifying optimal illumination conditions can be time-consuming, making it difficult to optimize optogenetic systems4,5. High-throughput methods to rapidly screen and characterize the activity of optogenetic systems can accelerate the design-build-test cycle for prototyping constructs and exploring their function.
The Lustro platform was developed as a laboratory automation technique designed for high-throughput screening and characterization of optogenetic systems. It integrates a microplate reader, illumination device, and shaking device with an automation workstation6. Lustro combines automated culturing and light stimulation of cells in microwell plates (Figure 1 and Supplementary Figure 1), enabling the rapid screening and comparison of different optogenetic systems. The Lustro platform is highly adaptable and can be generalized to work with other laboratory automation robots, illumination devices, plate readers, cell types, and optogenetic systems, including those responsive to different wavelengths of light.
This protocol demonstrates the setup and use of Lustro for characterizing an optogenetic system. Optogenetic control of split transcription factors in yeast is used as an example system to illustrate the function and utility of the platform by probing the relationship between light inputs and the expression of a fluorescent reporter gene, mScarlet-I7. By following this protocol, researchers can streamline the optimization of optogenetic systems and accelerate the discovery of new strategies for the dynamic control of biological systems.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث علم البصريات الوراثية باستخدام Lustro 

تجارب علم البصريات الوراثية عالية الإنتاجية في الخميرة باستخدام المنصة الآلية Lustro

Different devices such as bioreactors and microwell plate illuminators are currently available. Bioreactors offer fine temporal resolution but are limited in throughput. Microwell plate devices offer higher throughput, but lack automation for reliable recording of outputs over time.Lustro offers reliable and high throughput characterization of optogenetic systems in real time. It can also interface with assays that can be performed by liqui-handling robots. Optogenetic systems are an attractive tool due to the fine spatial and temporal control they offer over cellular behavior.The ability to design, build, and test optogenetic systems more rapidly will pave the way for better understanding and control of biological behavior.

يوضح الشكل 4 أ قيم التألق بمرور الوقت لسلالة بصرية وراثية تعبر عن مراسل فلوري يتحكم فيه عامل نسخ انقسام مستحث للضوء. تنعكس ظروف الإضاءة المختلفة المستخدمة في التجربة من خلال الاختلافات في دورة العمل ، والتي تمثل النسبة المئوية للوقت الذي يكون فيه الضوء مضاء. لوحظ أن مستوى ا...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Optogenetics Research Using Lustro at JoVE.com

يحدد هذا البروتوكول خطوات استخدام المنصة الآلية Lustro لإجراء توصيف عالي الإنتاجية للأنظمة الوراثية البصرية في الخميرة.

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

تتوفر حاليا أجهزة مختلفة مثل المفاعلات الحيوية ومصابيح ألواح microwell. تقدم المفاعلات الحيوية دقة زمنية دقيقة ولكنها محدودة الإنتاجية. توفر أجهزة لوحات Microwell إنتاجية أعلى ، ولكنها تفتقر إلى الأتمتة لتسجيل المخرجات بشكل موثوق بمرور الوقت.تقدم Lustro توصيفا موثوقا وعالي الإنتاجية للأنظمة البصرية الوراثية في الوقت الفعلي. يمكنه أيضا التفاعل مع المقايسات التي يمكن إجراؤها بواسطة روبوتات التعامل مع الليكويل. تعد الأنظمة البصرية الوراثية أداة جذابة بسبب التحكم المكاني والزماني الدقيق الذي توفره على السلوك الخلوي.إن القدرة على تصميم وبناء واختبار أنظمة البصريات الوراثية بسرعة أكبر ستمهد الطريق لفهم السلوك البيولوجي والتحكم فيه بشكل أفضل.

high-throughput-optogenetics-experiments-yeast-using-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

508 Views.  University of Wisconsin-Madison. تتوفر حاليا أجهزة مختلفة مثل المفاعلات الحيوية ومصابيح ألواح microwell. تقدم المفاعلات الحيوية دقة زمنية دقيقة ولكنها محدودة الإنتاجية. توفر أجهزة لوحات Microwell إنتاجية أعلى ، ولكنها تفتقر إلى الأتمتة لتسجيل المخرجات بشكل موثوق بمرور الوقت.تقدم Lustro توصيفا موثوقا وعالي الإن?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث علم البصريات الوراثية باستخدام Lustro 

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

Using Lustro for Automated High-Throughput Optogenetic Characterization of Yeast

Start by setting up the automation workstation. Incorporate a microplate illumination device, such as an optoPlate, that allows convenient robot gripper arm access. Next, process a spreadsheet with the available MATLAB script to program the optoPlate.Execute the light stimulation program by flashing onto the optoPlate. To program the robot, troubleshoot any potential errors to ensure the proper functioning of the carrier and LabWare definitions. Run an empty plate through the script loop multiple times to verify the robot gripper arm's ability to pick up and place the plate accurately.Next, select colonies from the plates to set up the sample plate. Then inoculate them into three milliliters of synthetic complete media in glass culture tubes. Incubate these cultures overnight at 30 degrees Celsius on a roller drum in the dark.In cuvette, dilute 200 microliters of the culture in one milliliter of synthetic complete medium. Record its optical density using a spectrophotometer. Next, dilute each overnight culture to an optical density of 0.1 in glass culture tubes.Pipette the diluted cultures into a 96-well plate. Include wells with blank media and non-fluorescent cells as negative controls. Incubate the sample plate in a shaker incubator at 30 degrees Celsius for five hours.Now, place the sample plate on the heater shaker. Initiate the automation script by clicking on Run. Once the initial measurement has been recorded on the plate reader, start the light stimulation program by switching on the power strip of the illumination device.The fluorescence values over time for an optogenetic strain showed that the overall fluorescence level was proportional to the duty cycle of the light stimulation. The corresponding optical density values were consistent, suggesting that growth remained unaffected by varying light conditions. Different optogenetic strains employed different responses to light pulse intensity, period, and duty cycle variations.