نود أن نشكر اندريا Kremsreiter للحصول على مساعدة فنية ممتازة. ويدعم عمل في مختبرنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM096088 وفيلاس الثقة من جامعة ويسكونسن - ماديسون.

1. طرق Luminometry الخميرة استخدام سلالة BYYT من خميرة الخباز. بل هو yvc1-tok1 المشتقة من BY4741 (ماتا، ura3D0، his3D1، leu2D0، lys2D0، yvc1 :: HIS3، tok1 :: kanMX4). تحويل الخلايا مع، معربا عن البلازميد aequorin pEVP1/Aeq-ليو اختيار والجرذان، معربا عن البلازميد TRPV4-أورا اختيار p416GPDV4، كما هو موضح في Batiza آخرون 26 و Loukin آخرون 24 استخدام الأساليب القياسية للبناء البلازميد والتحول 27 . تتوفر سلالة الخميرة والبلازميدات عند الطلب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة 2 مل من خلايا الخميرة بين عشية وضحاها لمرحلة ما بعد وغاريتمي في شاكر 30 ° C-ليو في أورا &quot;DCD&quot; التسرب المتوسطة 28 (البديل المنضب من كبريتات المتوسطة CMD-ليو-أورا 29)، على أن تستكمل مع 1M السوربيتول . تطعيم 200 ميكرولتر من هذه الثقافات إلى 1.8 مل من المتوسط ​​الطازجة تستكمل مع 2 ميكرومتر من luciferiن coelenterazine. تنمو في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى دون أن تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الأسمولية للثقافة (عادة في الميلي أسمول 1،400) وغيرها من الحلول (أدناه) باستخدام مقياس التناضح ضغط البخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 20 ميكرولتر من ثقافة جديدة في 12 ملم أنبوب luminometer لأنبوب luminometer واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للصدمة ناقص التوتر، إضافة 200 ميكرولتر من الحل، التي تحتوي على 25 ملي NaEGTA (الرقم الهيدروجيني 7.2) أو أسماء (الرقم الهيدروجيني 7.2) و500-100 مم كلوريد الصوديوم، (الأسمولية مجموعه 1،200-400 الميلي أسمول) تبعا لدرجة الصدمة المرجوة. باستمرار رصد التلألؤ وقبل لا يقل عن 120 ثانية بعد downshock ناضح، توقف إلا عن طريق عملية التخفيف وجيزة. سجل الناتج luminometer على جهاز كمبيوتر سطح المكتب وحدات التلألؤ النسبي (RUL). </li></ol> وإن لم يكن لدراسة TRPV4 المعدلة وراثيا، وقد استخدمنا البديل من بروتوكول أعلاه في نظام آلي لفحص ردود عدد كبير من سلالات الخميرة. س الدراسةو كانت الردود على قصور 30 أو 31 مفرط التناضح المحفزات من deletome الخميرة (جمع 4،906 الخميرة deletants أحادية الجينات) باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية وتحليلها مع برنامج المناظرة ناجحة. 2. و3. بويضة الكهربية طرق يستخدم أساليب الكهربية الأساسية 32. PCR تضخيم إطار القراءة المفتوح البرية من نوع أو متحولة TRPV4 باستخدام عالية الدقة PfuUtra البلمرة ودمجها في pGH19 33. هذا ينطوي على الإدراج دقيقة من ORF بين 5 &#39;و 3&#39; UTRs من القيطم-β غلوبين الجينات والمصب من T7 RNA-البلمرة المروج. خطي بناء المصب UTR 3 &#39;وتستخدم القوالب في في المختبر T7 RNA تفاعل البلمرة. استخدام التقنيات الجزيئية البيولوجية معيار 34. استخدام البويضات مرحلة V-VI من اكس. المورق. تربية الحيوانات، ovariecto جزئيةبلدي، وإزالة المغلف defolliculation، والمحي اتباع إجراءات موحدة 32،33،35. حقن 2-40 نانوغرام من كرنا حل لكل بويضة باستخدام microinjector التلقائي دروموند Nanoinject الثاني. حقن البويضات ~ 30 لكل مجموعة من التجارب. بعد الحقن TRPV4-كرنا، واحتضان البويضات في المتوسط ​​ND96 مع الجنتاميسين (100 ميكروغرام / مل) و 1 ميكرومتر الروثينيوم أحمر 14. 2. اثنين من الجهد الكهربائي المشبك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب البورسليكات ماصات تسجيل الزجاج من الدقة المتاح بال micropipettes 100 ميكرولتر بشكل فردي مع مجتذب ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب كلا الجهد القياس وأقطاب ماصة حقن الحالي يتم سحبها أن يكون لها فتحة غيض من ~ 1 ميكرون القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقطاب الردم مع 2 M بوكل مما أدى إلى 0.1-0.2 mΩ المقاومة. جبل لهم على headstages HS2A، الذي جنبا إلى جنب مع VG-2Ax100 الظاهري الارض المشبك حمام ترتبط، إلى واجهة مكبر للصوت 500 GeneClamp من خلال Digidata 1440 التحويل الرقمي. كسب<html> بيانات باستخدام برنامج pClamp10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البويضة التي سيتم اختبارها في حمام 1 مل في غرفة البلاستيك ملفقة التي شنت على مرحلة مجهر تشريح مع التكبير 20X. الحل هو حمام الظاهري على الارض عن طريق جسر أجار 3 M بوكل وسلك الفضة المكلورة وضعت على مقربة من البويضة ومتصلة VG-2A المرحلة الأرض الظاهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء غرفة لنضح المستمر مع الأنابيب البلاستيكية ومدخل ومخرج الحل. الاتصال يتم توصيل أنابيب مدخل إلى نظام نضح ملفقة، وهي متعددة من ست قذائف 50 مل حقنة، كل مليئة حلا مختلفا. يتم التحكم معدلات التغذية خطورة أي حل معين ل~ 2-3 مل / دقيقة باستخدام &quot;كيك&quot; المشابك منحدر على الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل كل من الأقطاب الكهربائية مع headstages على micromanipulators. تنفيذ الاختراقات الكهربائي من البويضة بواسطة المجهرية. </li></ol> 3. المشبك التصحيح فحص المباشر Mechanosensitivity &quot;&gt; الطرق الأساسية للالمشبك التصحيح بما في ذلك إعداد ماصة، وتشكيل GΩ ختم، وعلى تشكيل خلية أو وسائط رفعه هي تلك هاميل وآخرون 36 وكون 32. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الماصات الزجاج البورسليكات مع فتحة قطرها 1 ميكرومتر ~ في الطرف (فقاعة عدد 5-6) مع 98 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، و 10 ملي K +-HEPES، ودرجة الحموضة 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق ماصة المشبك التصحيح من خلال أنابيب بلاستيكية لحقنة 5 مل و من خلال T-المشتركة، أيضا إلى مقياس ضغط الدم. استخدام الكمبيوتر للتعامل مع كل من القطب والمخرجات مقياس ضغط الدم. الحصول على البيانات في 10 كيلوهرتز، ومن ثم لعب مرة أخرى من خلال تصفية ثماني قطب بسل في 1 كيلو هرتز لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقع مختلفة يمكن رفعه من نفس البويضة مرارا وتكرارا. هذه الممارسة تجعل من فحص النشاط الجزيئي TRPV4 أكثر كفاءة وموثوق بها. </li></ol>

<ol>
	<li>Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+TRP+channels.">An introduction to TRP channels.</a> Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+family+of+ion+channels.">The transient receptor potential family of ion channels.</a> Genome Biol. 12, 218 (2011).</li><li>Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vallinoid+transient+receptor+potential+channel+Trpv4:+From+structure+to+disease.">The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).</li><li>Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+puzzle+of+TRPV4+channelopathies.">The puzzle of TRPV4 channelopathies.</a> EMBO Rep.. , (2013).</li><li>Liedtke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vanilloid+receptor-related+osmotically+activated+channel+(VR-OAC),+a+candidate+vertebrate+osmoreceptor.">Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor.</a> Cell. 103, 525-535 (2000).</li><li>Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OTRPC4,+a+nonselective+cation+channel+that+confers+sensitivity+to+extracellular+osmolarity.">OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity.</a> Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).</li><li>Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trp12,+a+novel+Trp+related+protein+from+kidney.">Trp12, a novel Trp related protein from kidney.</a> FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).</li><li>Delany, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+human+vanilloid+receptor-like+protein,+VRL-2.">Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2.</a> Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).</li><li>Rock, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+TRPV4+cause+autosomal+dominant+brachyolmia.">Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia.</a> Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).</li><li>Krakow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+gene+encoding+the+calcium-permeable+ion+channel+TRPV4+produce+spondylometaphyseal+dysplasia,+Kozlowski+type+and+metatropic+dysplasia.">Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia.</a> Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).</li><li>Camacho, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+TRPV4+mutations+in+nonlethal+and+lethal+metatropic+dysplasia.">Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia.</a> Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+permeation+through+the+cation+channel+TRPV4.">Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+TRPV4+gating+by+intra-+and+extracellular+Ca2.">Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2.</a> Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+brachyolmia-causing+mutant+TRPV4+channels+respond+directly+to+stretch+force.">Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force.</a> J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).</li><li>Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-modulated+diversity+of+TRPV4+channel+gating:+activation+by+physical+stresses+and+phorbol+ester+derivatives+through+protein+kinase+C-dependent+and+-independent+pathways.">Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways.</a> J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).</li><li>Watanabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+and+arachidonic+acid+use+epoxyeicosatrienoic+acids+to+activate+TRPV4+channels.">Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels.</a> Nature. 424, 434-438 (2003).</li><li>Vriens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+swelling,+heat,+and+chemical+agonists+use+distinct+pathways+for+the+activation+of+the+cation+channel+TRPV4.">Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).</li><li>Vincent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+TRPV4+modulators.">Identification and characterization of novel TRPV4 modulators.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).</li><li>Willette, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+activation+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid+subtype+4+channel+causes+endothelial+failure+and+circulatory+collapse:+Part+2.">Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).</li><li>Thorneloe, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orally+active+TRPV4+channel+blocker+prevents+and+resolves+pulmonary+edema+induced+by+heart+failure.">An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+dysplasia+caused+by+a+constitutive+activated+transient+receptor+potential+vanilloid+4+(TRPV4)+cation+channel+mutation.">Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation.</a> Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).</li><li>Lamande, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TRPV4+cause+an+inherited+arthropathy+of+hands+and+feet.">Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet.</a> Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Basal+Activity+Is+a+Key+Determinant+in+the+Severity+of+Human+Skeletal+Dysplasia+Caused+by+TRPV4+Mutations.">Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypotonic+shocks+activate+rat+TRPV4+in+yeast+in+the+absence+of+polyunsaturated+fatty+acids.">Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids.</a> FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).</li><li>Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+reveals+multiple+gating+mechanisms+of+TRPV4.">Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4.</a> J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).</li><li>Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+respond+to+hypotonic+shock+with+a+calcium+pulse.">Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse.</a> J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmoprotective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell+wall-compromised+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Denis, V., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Ca(2+)+release+in+yeast+is+triggered+by+hypertonic+shock+and+mediated+by+a+TRP+channel+homologue.">Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.</a> J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).</li><li>Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+perturbations+sensitize+osmotic+down-shock+activated+Ca2++influx,+a+yeast+&amp;#34;deletome&amp;#34;+analysis.">Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast &amp;#34;deletome&amp;#34; analysis.</a> FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).</li><li>Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+survey+suggests+an+osmo-protective+role+for+vacuolar+Ca2++release+in+cell-wall-compromized+yeast.">A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast.</a> FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).</li><li>Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 294, (1999).</li><li>Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).</li><li>Loukin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+a+region+important+for+gating+of+the+yeast+K++channel+Ykc1.">Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1.</a> EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC1+forms+the+stretch-activated+cation+channel+in+vertebrate+cells.">TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells.</a> Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

كما جاء في المقدمة، الطرق المستخدمة شيوعا لدراسة وظائف TRPV4 أدى في بعض الأحيان في التناقضات والخلافات. مجموعتين من الأساليب المذكورة هنا توفر بعض المزايا ويمكن أن تكمل الطرق القائمة. في حين وصفنا فقط على الدراسات TRPV4، ويجوز تمديد الطرق لدراسة قنوات الأيونات الأخرى كذ?...

تضم الحزب الراديكالي عبر الوطني (إمكانات مستقبلات عابرة) سبعة تحت العوائل من القنوات الموجبة التي تخدم الوظائف الحسية 1،2. في الثدييات، TRPV، فصيلة vanilloid من الحزب الراديكالي عبر الوطني، لديه ستة أصناف. TRPV4 (نوع 4) 3،4 يستجيب للحرارة وبعض المواد الكيميائية، وتورم التناضحي، أو إجهاد القص. تم عزل الجين TRPV4 مرارا وتكرارا من قبل مرشح الجينات و / أو التعبير استنساخ 5-8. يتبع الأسلوب الأخير استجابة الجين المنتج لقصور الأسمولية. وأعرب عن TRPV4 في ما يقرب من جميع الأجهزة وظائف في تطوير وظائف الأعضاء، علم الأمراض أو من العديد من أنواع الخلايا المختلفة 3،4. لفتا هي&gt; 50 جسمية الإنسان الطفرات TRPV4 المهيمنة، مما تسبب اعتلال الأعصاب الطرفية و / أو خلل التنسج العظمي (تشوهات في الهيكل العظمي التنمية) 9-11. خلل التنسج العظمي تتراوح بين معتدلة نوع brachyomia 3 (نوع 3 التقزم) وخلل التنسج spondylometaphyseal نوع كوزلوفسكي، لسفإعادة خلل التنسج، مما تسبب في بعض وفيات الولدان أو الجنينية. على الرغم من جميع الخلق من الآليات يبدو ممكنا، لا شيء يفسر التنوع والتعقيد، وتقلب، والتداخل في بعض الأحيان من هذه الأمراض 4. مثل القنوات الأخرى TRP 1، TRPV4 هو tetramer. في الفئران أو TRPV4 الإنسان، يتكون كل الوحيدات من 871 المخلفات. العنصر المركزي هو الغشاء ستة من اللوالب (S1-S6)، والتي من المرجح رتبت بطريقة مشابهة لK + قنوات الجهد بوابات. هناك، S1 إلى S4 تشكيل المجال الطرفية وS5 S6 وتشكل المجال تخلل المسام. S5 S6 بين وTRPV4 من هو الحلزون المسام قصيرة تليها LDLFKLTIGMGDL تسلسل، أربعة منها تتلاقى يفترض أن يشكل مرشح الموجبة. و470-بقايا الجزء حشوية N-محطة يحتوي على 6 يكرر ankyrin، والمعروف أن ربط البروتينات أو بروابط صغيرة. ويشمل الجزء حشوية 152-C-بقايا محطة تسلسل ملزمة كالمودولين بين المواقع المحتملة الأخرى التي تربط التمديدعناصر لها 3. TRPV4 هي قناة الموجبة التي تستثني أساسا الأنيونات 1. بينما وظيفتها الفسيولوجية هو تنبيغ المحفزات لكا 2 + تدفق، بل هو أيضا قابلة للاختراق لالكاتيونات الأخرى مع تسلسل نفاذية آيزنمان الرابع، لصالح ثنائي التكافؤ في كاليفورنيا P: P نا ~ 7 12. يصحح على قناة واحدة تصرف في ~ 90 ~ PS الخارج والداخل 40 PS 6،13،14. أعرب Heterologously الحالية (أدناه) يمكن تفعيلها من خلال الاسموزي للفراش لا تسبب تورم، وإجهاد القص، أو الدفء 15. يتم تنشيط أيضا من قبل الأحماض الدهنية غير المشبعة و16،17 استر phorbal الاصطناعية 4αPDD 18. في الوقت الحاضر، وناهض هو أقوى GSK1016790A 19 وخصم هو GSK2193874 وفعالة في 10 -9 إلى 10 -8 M 20، وكلاهما اكتشف بواسطة الإنتاجية العالية، وشاشة صغيرة الجزيئية. يظل مجالين رئيسيين للبحوث TRPV4 مربكة: (1) وحتى يتم دراسة TRPV4 إلى حد كبير عن mechanosensitivity لها، أساسها الجزيئي أمر مثير للجدل. يصف نموذج واحد قصور الأسمولية ينشط بطريقة أو بأخرى فسفوليباز A2 (PLA2) لإنتاج حمض غير مشبع الدهنية (بوفا) حمض الأراكيدونيك (AA)، والتي يتم تحويلها إلى حمض epoxyeicosatrienoic (EET) من قبل epoxygenase، وربط EET ينشط TRPV4 16، 17. بعد، وقد تبين TRPV4 نفسها للرد مباشرة على غشاء تمتد 14 (أدناه)، وتوفير أبسط تفسير. (2) وأمراض متحولة TRPV4 محيرة. في الأساس، ويحتاج المرء إلى معرفة ما إذا كانت الأمراض هي نتيجة لفقدان أو تخفيض، أو زيادة أنشطة القناة. حتى هنا، فإن الأدب هو أبعد ما يكون عن الوضوح. في حين تم الإبلاغ عن عدة الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج لديك أنشطة العالي، (مكاسب من وظيفة، GOF) 4،21، تم الإبلاغ عن عدة أن ينخفض ​​الأنشطة (الخسارة من وظيفة، LOF) 10،22. دراسة منهجية ل14 الأليلات جدت لها أنجميع الطفرات أن صندوق القناص (أدناه) 23. الادعاء بأن بعضها LOFs يبدو أن تتعارض مع النمط الظاهري من trpV4 / - خروج المغلوب الماوس، والتي هي قابلة للحياة أو الخصبة، مع عيوب طفيفة فقط، على الرغم من خسارة كاملة من وظيفة TRPV4. وهناك جزء من هذه الخلافات وأصله المنهجية. مختبرات استخدام أساليب مختلفة، أو أنواع من أسلوب واحد، وتوظيف معايير التحكيم المختلفة. الأكثر شيوعا، وأعرب عن TRPV4 عابر في خلايا الثدييات مثقف (كلوة الجنين البشري، شو، هيلا) مسجلة وصعود الداخلية [كا 2 +] على ناهض أو التحفيز ناقص التوتر مع كا 2 صبغة الفلورسنت الحساسة لل+، FURA-2. وقد انتقد الاعتماد المفرط على هذا الاختبار فلوروميتريك 1. مستوى التعبير في مختلف قطاعات السكان، والتوزيع فيه، فضلا عن تركيز الصبغة فعالة، يجب أن يكون للرقابة وتوثيقها. هو أكثر موثوقية الامتحانات الكهربية مباشرة. حتى هذا، كما commonlذ يمارس، هو أيضا لا يخلو من المشاكل. لأن مستويات التعبير في الخلايا المستزرعة الفردية هي من الصعب السيطرة عليها، والتيارات خلية كاملة لديها اختلافات كبيرة. أبعد من ذلك، لأن التيارات الصغيرة، وسوف إحصاءات موثوقة أن تعتمد على عينات كبيرة الحجم، غالبا ما تكون غير عملية. ونادرا ما أجريت فحوصات التصحيح، المشبك. تظهر بعض هذه التسجيلات مجموعات من رشقات نارية النشاط التي تجعل التقييم الإحصائية تحديا 16،17. إلى فهم أفضل للmechanosensitivity الجزيئية، قمنا بتطوير نظامين إضافية لدراسة TRPV4. (1) لعزل TRPV4 بعيدا عن شركائها الثدييات المعتادة، أبدينا TRPV4 الفئران في مهدها الخميرة 24. أظهرت التعبير الوظيفي للTRPV4 في هذا السياق بعيدة تطويريا أنه لا يزال من الممكن الرد على القوة الاسموزي دون شركائها المعتادة. لأن الخميرة لا تقدم أي PUFAs مثل AA أو EET، والجينوم لا يوجد لديه PLA2 أو epoxygenase الجينات، وهذا expreيظهر ssion أيضا أن لا حاجة لها للTRPV4 لاستشعار القوة. وجود TRPV4 في حقيقيات النوى الجزيئية البيولوجية الأكثر قابلية يسمح أيضا التلاعب فعالة إلى الأمام أو عكس الوراثية 25. (2) لفي عمق التحليلات الفيزيائية الحيوية من TRPV4، عبرنا عن TRPV4 في البويضات القيطم. على عكس الخلايا المستزرعة، والتي تسفر الفرعية غ لنا (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات، بويضة عن التيارات في لأمبير (10 -6 إلى 10 -4 A). إشارة أكبر بكثير على الضوضاء يسمح أفضل الكمي والمقارنة أكثر ثقة. TRPV4، لذلك أعرب، ويمكن أيضا أن تدرس كما الجزيئات الفردية باستخدام المشبك التصحيح. A بويضة واحدة يسمح أخذ العينات التصحيح المتكررة، مرة أخرى مما يجعل الكمي أكثر موثوقية. وأظهرت هذه الدراسات أن TRPV4 قناة نفسها يمكن تفعيلها مباشرة بالقوة تمتد غشاء 14. وأظهرت التحاليل أيضا أن 14 ممثل الأليلات الهيكل العظمي، خلل التنسج كلها مكاسب من وظيفة الطفرات. علاوة على ذلك، degrه ه من هذا التسرب + التأسيسية كا 2 يوازي شدة الأمراض الهيكل العظمي 23. لأن الجدة وجدواها، ويتم تجميع الإجراءات التفصيلية من هاتين الطريقتين هنا للسماح مكررات في البحوث المستقبلية على TRPV4 أو قنوات مماثلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td style="width:93px;">Wescor</td>
			<td style="width:119px;">Wescor 5500</td>
			<td style="width:167px;">Logan, UT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sirius Single Tube Luminometer </td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berhold</td>
			<td style="width:119px;">Sirius </td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microplate luminometer</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold </td>
			<td style="width:119px;">Mithras LB940</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Luminometry software</td>
			<td style="width:93px;">Titertek-Berthold</td>
			<td style="width:119px;">MikroWin2000</td>
			<td>Huntsville, LA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:216px;">Patch clamp and software</td>
			<td style="width:93px;">Axon Instrument</td>
			<td style="width:119px;">HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software </td>
			<td>Union City, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">manometer</td>
			<td style="width:93px;">Bio-Tec</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Winooski, VT, USA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pipet puller</td>
			<td style="width:93px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:119px;">Model P-97</td>
			<td>Novata, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:93px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanoinject II</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material:</td>
			<td style="width:93px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">luciferin coelenterazine</td>
			<td style="width:93px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">T7 RNA polymerase reaction</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">mMessage mMachine</td>
			<td>Austin, TX, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ruthenium red </td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micropipets </td>
			<td style="width:93px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">100 microliter micropipets</td>
			<td>Broomall, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-fidelity PfuUtra polymerase </td>
			<td style="width:93px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>La Jolla, CA, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast luminometric and xenopus oocyte electrophysiological examinations of the molecular mechanosensitivity of trpv4

وأعرب عن TRPV4 (عابر مستقبلات الإمكانيات، والأسرة vanilloid، نوع 4) على نطاق واسع في أنسجة الفقاريات ويتم تفعيلها من خلال العديد من المحفزات، بما في ذلك القوات الميكانيكية. الطفرات TRPV4 معينة يسبب العظام وراثية معقدة أو الأمراض العصبية في الإنسان. وأعرب البرية من نوع أو متحولة الجينات المحورة TRPV4 عادة في خلايا الثدييات مثقف وفحصها من قبل FURA-2 قياس التألق والأقطاب الكهربائية. من حيث آلية mechanosensitivity والأسس الجزيئية للأمراض، والأدب الحالي هو مربكة ومثيرة للجدل. لاستكمال الأساليب القائمة، ونحن تصف طريقتين إضافية لدراسة الخصائص الجزيئية للTRPV4. (1) يتم تحويلها الجرذ TRPV4 والتحوير aequorin في مهدها الخميرة. صدمة للفراش لا تسبب osmtic من السكان المحولة تعطي إشارة luminometric بسبب مزيج من aequorin مع كا 2 +، الذي صدر من خلال قناة TRPV4. هنا يتم عزل TRPV4 من البروتينات شريك الثدييات المعتادةويكشف mechanosensitivity الخاصة. (2) يتم حقن كرنا من TRPV4 في البويضات القيطم. بعد فترة مناسبة من الحضانة، يتم فحص TRPV4 الحالية العيانية مع الجهد المشبك يومين القطب. الارتفاع الحالي على إزالة osmoticum خاملة من الحمام البويضة يدل على mechanosensitivity. ومكرو أمبير (10 -6 إلى 10 -4 أ) التيارات من البويضات تكون أكبر بكثير من subnano إلى nanoAmpere (10 -10 إلى 10 -9 A) التيارات من الخلايا المستزرعة، مما أسفر عن quantifications أكثر وضوحا وأكثر ثقة المقررة. ويمكن أيضا أن التيارات المجهرية التي تعكس أنشطة البروتينات قناة الفردية تكون مسجلة مباشرة تحت المشبك التصحيح، في على خلايا أو وضع رفعه. يوفر نفس البويضة عينات التصحيح متعددة، مما يسمح نسخ البيانات على نحو أفضل. يمكن تطبيقها على الشحوم بقع تفعيل TRPV4 لتقييم mechanosensitivity مباشرة. ينبغي أيضا أن تكون هذه الأساليب مفيدة في دراسة أنواع أخرى من القنوات TRP.

في تجربة نموذجية luminometry، ويتحقق مجموعة من 400-1،200 الميلي أسمول الصدمات ناقص التوتر إلى أسفل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من الحلول صدمة مختلفة الأسمولية المنخفضة إلى 20 ميكرولتر من الثقافة في 1،400 الميلي أسمول. النشاط TRPV4 هو واضح عند مقارنة RLU من التجريبية إلى أن اثنين من الض...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4 at JoVE.com

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

لاستكمال الأساليب المستخدمة شيوعا لدراسة TRPV4، ويتم وصف طريقتين: mechanosensitivity ويمكن لها أن تدرسها كا 2 + luminometry-aequorin في الخميرة المعدلة وراثيا على التحدي للفراش لا تسبب الاسموزي. فإنه يمكن أيضا أن تدرس في TRPV4-RNA حقن البويضات القيطم من قبل خلية كاملة يومين الجهد الكهربائي المشبك المشبك أو التصحيح في خلية أو في وضع رفعه.

Luminometric الخميرة و<em&gt; القيطم</em&gt; سيت الكهربية الامتحانات من Mechanosensitivity الجزيئي للTRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

yeast-luminometric-xenopus-oocyte-electrophysiological-examinations

Research

JoVE Journal

Biology

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

10.0K Views.  University of Wisconsin – Madison.  لاستكمال الأساليب المستخدمة شيوعا لدراسة TRPV4، ويتم وصف طريقتين: mechanosensitivity ويمكن لها أن تدرسها كا 2 + luminometry-aequorin في الخميرة المعدلة وراثيا على التحدي للفراش لا تسبب الاسموزي. فإنه يمكن أيضا أن تدرس في TRPV4-RNA حقن البويضات القيطم من ق...

Video: Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

تقنية التصوير السريع للخلايا الخميرة لايف مشلول

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

ال<em&gt; القيطم</em&gt; سيت قص مفتوحة الفازلين جاب الجهد المشبك تقنية مع التألق

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...