تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226 ، 81760223) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة يونان (202001AS070045 ، 202301AY070001-011) ، ومؤسسة البحث العلمي التابعة لوزارة التعليم بمقاطعة يوننان (2023Y0784).

حصل هذا البحث على موافقة من لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). التزمت جميع التجارب بالمبادئ التوجيهية المعمول بها لرعاية. تم حصاد الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) من ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن ما بين 20-25 جم. تم شراء هذه الفئران من جامعة كونمينغ الطبية في كونمينغ ، الصين. تم إجراء الإجراء التجريبي بأكمله في ظل ظروف معقمة صارمة. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد الكواشف والأدوات
ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات التي تتضمن حلولا داخل خزانة مخاطر بيولوجية من الفئة الثانية.
<ol><li>قم بإعداد محلول الغسيل عن طريق خلط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (P / S) (انظر جدول المواد). حافظ على هذا المخزن المؤقت باردا عند 4 درجات مئوية. من الضروري تحضيره طازجا في يوم الاستخدام وإزالة الغاز من المخزن المؤقت.</li>
	<li>تحضير الإنزيمات الهاضمة عن طريق الجمع بين 10 مل من PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) مع 2 مل من 0.25٪ تربسين ، 1 مل من 20 مجم / مل غراء ، و 200 ميكرولتر من 1 مجم / مل كولاجيناز I (انظر جدول المواد). ملاحظة: تأكد من استخدام حصص الأحجام المناسبة لمنع تكرار دورات التجميد والذوبان. قم بتخزين هذه القسوم في درجة حرارة -20 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإعداد وسط الاستزراع من خلال استخدام مجموعة وسائط نمو الخلايا البطانية المتاحة تجاريا ، والتي تشمل VEGF-C (100 نانوغرام / مل) و 1٪ P / S (انظر جدول المواد).</li>
	<li>قم بإعداد المخزن المؤقت للإيقاف عن طريق استكمال وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بنسبة 10٪ FBS لإيقاف عملية الهضم.</li>
	<li>تحضير الأدوات الجراحية المعقمة: يجب أن تشتمل هذه الأدوات على مقص وملاقط مسننة وملاقط دقيقة.</li>
</ol>2. طلاء قارورة
<ol><li>قم بتغطية دورق T25 بمحلول فيبرونيكتين 100 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بإزالة محلول الطلاء باستخدام ماصة.</li>
	<li>اغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم قم بشفط PBS ، واترك قارورة T25 تجف في الهواء.</li>
</ol>3. تفكك Leptomeninges
ملاحظة: استخدم دائما المخازن المؤقتة والمحاليل المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية.
<ol><li>تخدير الفئران باستنشاق زائد من 4٪ إيزوفلوران ثم التضحية بها عن طريق قطع الرأس السريع باستخدام مقص تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.</li>
	<li>شق الجلد بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة وتمتد نحو المنطقة الأمامية.</li>
	<li>قم بإزالة الجمجمة بدقة ، وارفعها برفق بالمقص لتجنب إتلاف اللبتونينج ، مما يضمن الحصول على الدماغ بالكامل ، بما في ذلك leptomeninges.</li>
	<li>اغمر الدماغ كله في مخزن مؤقت للغسيل واغسله برفق لإزالة الدم السطحي.</li>
	<li>نقل الدماغ إلى طبق بتري معقم دون تقطيع ، واستخراج leptomeninges من سطح الدماغ باستخدام ملاقط دقيقة تحت المجهر.</li>
	<li>قطع الأنسجة leptomeninges إلى شظايا باستخدام مقص دقيق معقمة.</li>
</ol>4. Leptomeninges الهضم الأنزيمي
<ol><li>أضف 10 مل من مزيج الإنزيم (الخطوة 1.2) إلى الشظايا واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. حرك برفق لضمان فصل الشظايا عن قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت للإيقاف (الخطوة 1.4) لوقف عملية الهضم.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.</li>
	<li>أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد ، وقم بتمرير الخليط من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب معقم سعة 50 مل لتصفية أي كتل.</li>
</ol>5. توسيع الخلية
<ol><li>لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم 2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين (الخطوة2) مع5 مل من وسط الاستزراع.</li>
	<li>احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط للتخلص من الخلايا غير المرفقة.</li>
	<li>الحفاظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يومين. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.</li>
</ol>6. اختيار الخلية المغناطيسية
ملاحظة: اعمل بسرعة ، وحافظ على برودة الخلية ، واستخدم المحاليل المبردة مسبقا لمنع وضع علامات غير محددة على الخلايا.
<ol><li>تحضير الأدوات والكواشف: قم بتوصيل فاصل مغناطيسي بحامل فاصل مغناطيسي (انظر جدول المواد). قم بتوصيل عمود التحديد بالفاصل المغناطيسي ، وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق عمود التحديد. ضع أنبوبا سعة 50 مل أسفل عمود التحديد لجمع التدفق.</li>
	<li>الهضم الأنزيمي: بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، قم بشفط الوسط وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة المخزن المؤقت للتوقف. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.</li>
	<li>حضانة الأجسام المضادة: أعد تعليق 1 × 107 خلايا إجمالية في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1 (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.<ol><li>أدر الخلايا على 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. شطف الخلايا عن طريق إدخال 1 مل من PBS والطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. تماما إزالة طاف.</li>
	</ol></li>
	<li>وضع العلامات على الميكروبيدات: أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.<ol><li>أدر الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وصب المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتطهير الخلايا باستخدام 1 مل من PBS من خلال الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية تماما.</li>
	</ol></li>
	<li>الاستبعاد السلبي المغناطيسي: أعد تعليق الخلايا في 4 مل من PBS. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر للتخلص من الكتل. قم بإعداد عمود التحديد (انظر جدول المواد) عن طريق شطفه ب 3 مل من PBS ، ثم قم بتطبيق تعليق الخلية في عمود التحديد.<ol><li>قم بإجراء خطوات الغسيل باستخدام 3 مل من PBS واجمع الخلايا السالبة LYVE-1 في أنبوب سعة 50 مل يتم وضعه أسفل عمود التحديد للسماح لها بالمرور.</li>
	</ol></li>
	<li>الاختيار الإيجابي المغناطيسي: ماصة 6 مل من PBS في عمود التحديد. اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية على الفور عن طريق دفع المكبس بقوة في عمود التحديد للحصول على LLECs إيجابية LYVE-1. ملاحظة: انتظر دائما حتى يصبح خزان عمود التحديد فارغا قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.</li>
</ol>7. ثقافة الشركات ذات المسؤولية المحدودة
<ol><li>قم بطرد مركزي LLECs الإيجابية LYVE-1 عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.</li>
	<li>لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين مع5 مل من وسط الثقافة.</li>
	<li>حافظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، افصل الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين وقم بمرور الخلية. استخدم الخلايا للتجارب اللاحقة بعد 2-3 ممرات.</li>
</ol>8. تحليل التدفق الخلوي
ملاحظة: تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باتباع الإجراء15 الموضح سابقا.
<ol><li>أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أضف المخزن المؤقت لوقف عملية الهضم.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ونضح تماما طاف طفا. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS.</li>
	<li>أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا بكمية مناسبة من المخزن المؤقت PBS للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي وبرنامج FlowJo (انظر جدول المواد).</li>
</ol>9. تلطيخ المناعي
ملاحظة: تم إجراء تلطيخ المناعي باتباع الإجراء الموصوف سابقا16.
<ol><li>اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من PFA واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.</li>
	<li>ضع المخزن المؤقت للكتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للكتلة من أغطية الغطاء.</li>
	<li>أضف الجسم المضاد LYVE-1 في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانه في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانها في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>كاونتر ستاين مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI). الخلايا جاهزة الآن للفحص المجهري المناعي.</li>
</ol>

إنشاء مزارع LLEC في المختبر باستخدام اختيار الخلايا المغناطيسية

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium.">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنه.

لم يتم الإبلاغ من قبل عن البروتوكول الحالي لحصاد واستزراع LLECs في المختبر . تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الإجراءات قابل للتكرار لحصاد وزراعة LLECs من leptomeninges الفئران.
في حين أن هذا البروتوكول متعدد الإجراءات قابل للتكرار ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات الرئيسية. على...

تشكل الخلايا البطانية اللمفاوية المكتشفة حديثا (LLECs) شبكة من الخلايا الفردية داخل leptomeninges ، وتظهر نمط توزيع متميز عند مقارنتها بالخلايا البطانية اللمفاوية المحيطية 1,2. لا تزال الوظائف الخلوية والآثار السريرية المرتبطة ب LLECs منطقة مجهولة إلى حد كبير. من أجل تمهيد الطريق للبحث الوظيفي على LLECs ، من الضروري إنشاء نموذج في المختبر لدراستهم. لذلك ، ابتكرت هذه الدراسة بروتوكولا شاملا للعزل والثقافة الأولية ل LLECs.
الفئران هي النموذج الحيواني المفضل بسبب ملاءمتها للتلاعب الجيني في أبحاث الأمراض. نجحت الدراسات السابقة في عزل الخلايا البطانية اللمفاوية من أنسجة الفئران المختلفة ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية3 ، والأنسجة المساريقية4 ، والأنسجة الجلدية5 ، وجمع اللمفاويات6 ، وأنسجة الرئة7. اعتمدت إجراءات العزل هذه بشكل أساسي على تقنيات مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) وفرز قياس التدفق الخلوي8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، أدت الجهود البحثية إلى إنشاء خطوط الخلايا العنكبوتية للفئران وخطوط الخلايا الشعرية اللمفاوية للفئران11,12. على الرغم من وجود تقنيات الاستزراع الخارجي ل leptomeninges13 ، إلا أن هناك حاجة ملحة لبروتوكول موحد لعزل وزراعة LLECs. وبالتالي ، نجحت هذه الدراسة في حصاد وزراعة LLECs من خلال فصل leptomeninges بدقة تحت إشراف المجهر وتعزيز توسع LLECs من خلال استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C). العلامة المميزة للخلايا البطانية اللمفاوية هي مستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) 14. يقوم هذا البروتوكول متعدد الخطوات بعزل LLECs الإيجابية LYVE-1 بشكل انتقائي باستخدام MACS ويتحقق لاحقا من نقائها من خلال التحليل الخلوي للتدفق وتلطيخ الفلورسنت المناعي.
يمكن تلخيص الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول متعدد الخطوات على النحو التالي: طلاء القارورة ، تفكك leptomeninges ، الهضم الأنزيمي لل leptomeninges ، توسع الخلايا ، اختيار الخلايا المغناطيسية ، والثقافة اللاحقة ل LLECs. أخيرا ، يتم تأكيد نقاء LLECs المعزولة من خلال تحليل التدفق الخلوي وتلطيخ الفلورسنت المناعي. الهدف الشامل من هذه الدراسة هو تقديم بروتوكول قابل للتكرار ومتعدد الخطوات لعزل LLECs من leptomeninges الفئران وثقافتها اللاحقة في المختبر . هذا البروتوكول مهيأ لتسهيل التحقيقات بشكل كبير في الوظائف الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) هي مجموعة خلوية داخل الجمجمة تم اكتشافها مؤخرا مع توزيع فريد متميز بوضوح عن الخلايا البطانية اللمفاوية الطرفية. وظيفتها الخلوية وآثارها السريرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توافر إمدادات من LLECs أمر ضروري لإجراء البحوث الوظيفية في المختبر. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول قائم لحصاد وزراعة LLECs في المختبر.
نجحت هذه الدراسة في حصاد LLECs باستخدام بروتوكول متعدد الخطوات ، والذي تضمن طلاء القارورة بالفبرونيكتين ، وتشريح الليبتومينيات بمساعدة المجهر ، وهضم الليبتومينيات إنزيميا لإعداد تعليق أحادي الخلية ، مما يؤدي إلى توسع LLECs مع عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C) ، واختيار الخلايا الإيجابية لمستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) من خلال فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). أدت هذه العملية في النهاية إلى إنشاء ثقافة أولية. تم تأكيد نقاء LLECs من خلال تلطيخ التألق المناعي وتحليل التدفق الخلوي ، مع مستوى نقاء يتجاوز 95٪. وقد أثبت هذا البروتوكول متعدد الخطوات قابلية التكرار والجدوى ، مما سيسهل إلى حد كبير استكشاف الوظيفة الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal 

الحصاد والزراعة الأولية للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الخطوات قابل للتكرار لحصاد الخلايا البطانية اللمفاوية (LLECs) من الفئران وبالتالي إنشاء ثقافتها الأولية في المختبر. تتضمن الخطوات الرئيسية تحضير القارورة وطلاء الفبرونيكتين ، وتفكك الليبتومينينج ، والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال الهضم الأنزيم?...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Cellular Functions and Potential Clinical Implications of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) ، وهي نوع من الخلايا داخل الجمجمة تم تحديده مؤخرا ، لها وظائف غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قابلا للتكرار لحصاد LLECs من الفئران وإنشاء مزارع أولية في المختبر . تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين الباحثين من الخوض في الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة ل LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

تم تصميم هذا البروتوكول للمناطق من قبل باحثين آخرين مهتمين فقط حيث تم إنشاء إجراء متعدد للمناطق الأولية والثقافية أدى بروتوكولنا في النهاية إلى إنشاء ثقافتنا الأولية للمنطقة CS بمستوى نقاء يتجاوز 95٪ لا يوجد حاليا بروتوكول حالي للحصاد والزراعة مهدت نتائجنا الطريق لمزيد من التحقيق في الوظيفة المماثلة ل LLECS في الوضع الافتراضي. في RUC ، اكتشافنا الأخير للسكان الخلويين داخل الجمجمة ، الأهمية البيولوجية ل RUC سنجري المزيد من الأبحاث حول الوظيفة الخلوية ونراجع آثارها السريرية.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

873 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. تم تصميم هذا البروتوكول للمناطق من قبل باحثين آخرين مهتمين فقط حيث تم إنشاء إجراء متعدد للمناطق الأولية والثقافية أدى بروتوكولنا في النهاية إلى إنشاء ثقافتنا الأولية للمنطقة CS بمستوى نقاء يتجاوز 95٪ لا يوجد حاليا بروتوكول حالي للحصاد والزراعة مهدت نتائجنا الطريق لمزيد من ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: الكشف عن الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة للخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

تفكك Leptomeninges الفأر والهضم الأنزيمي للاستزراع الفعال للخلايا leptomeningeal

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.