이 연구는 중국 국립자연과학재단(81960226, 81760223), 윈난성 자연과학재단(202001AS070045, 202301AY070001-011), 윈난성 교육부 과학연구재단(2023Y0784)의 보조금으로 지원됐다.

본 연구는 쿤밍의과대학 동물실험윤리위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았다. 모든 실험은 확립된 동물 관리 지침을 준수했습니다. 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 6-8주 되고 체중이 20-25g인 수컷 C57Bl/6J 마우스로부터 수확했습니다. 이 쥐들은 중국 쿤밍에 있는 쿤밍 의과대학에서 조달했다. 전체 실험 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행되었습니다. 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다.
1. 시약 및 기구 준비
알림: 용액과 관련된 모든 단계는 클래스 II 생물학적 위험 캐비닛 내에서 수행해야 합니다.
<ol><li>인산염 완충 식염수(PBS)를 칼슘 및 마그네슘, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)과 혼합하여 세척 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조). 이 버퍼를 4°C에서 차갑게 유지하십시오. 사용 당일에 신선하게 준비하고 완충액의 가스를 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>10mL의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외)를 0.25% 트립신 2mL, 20mg/mL 파파인 1mL, 1mg/mL 콜라겐분해효소 I 200μL와 결합하여 소화 효소를 준비합니다( 재료 표 참조). 알림: 반복적인 동결-해동 주기를 방지하기 위해 적절한 부피의 부분 표본을 사용하십시오. 이 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>VEGF-C(100ng/mL) 및 1% P/S를 포함하는 시판되는 내피 세포 성장 배지 키트를 활용하여 배양 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>분해 과정을 중지하기 위해 10% FBS로 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 보충하여 중지 완충액을 준비합니다.</li>
	<li>멸균 수술 기구 준비: 이러한 기구에는 가위, 톱니 모양의 팁 핀셋 및 미세한 핀셋이 포함되어야 합니다.</li>
</ol>2. 플라스크 코팅
<ol><li>T25 플라스크에 100μg/mL 피브로넥틴 용액( 재료 표 참조)을 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 사용하기 전에 피펫을 사용하여 코팅 용액을 제거하십시오.</li>
	<li>PBS로 플라스크를 세 번 세척한 다음 PBS를 흡입하고 T25 플라스크를 자연 건조시킵니다.</li>
</ol>3. 렙토메닝 해리
알림: 항상 4°C에서 미리 냉각된 완충액과 용액을 사용하십시오.
<ol><li>4% 이소플루란을 과도하게 흡입하여 쥐를 마취한 다음 이전에 70% 에탄올로 세척한 가위를 사용하여 신속하게 목을 베어 희생합니다.</li>
	<li>두개골 뒤쪽의 구멍에서 시작하여 전두엽 부위로 뻗어 정중선을 따라 피부를 조심스럽게 절개합니다.</li>
	<li>두개골을 조심스럽게 제거하고 가위로 부드럽게 들어 올려 연수막을 손상시키지 않도록 하여 연수막을 포함한 뇌 전체를 얻습니다.</li>
	<li>뇌 전체를 세척 완충액에 담그고 부드럽게 씻어내어 표면 혈액을 제거합니다.</li>
	<li>뇌를 자르지 않고 멸균된 페트리 접시에 옮기고 현미경으로 미세한 핀셋을 사용하여 뇌 표면에서 렙토메닝을 추출합니다.</li>
	<li>멸균 마이크로 가위를 사용하여 렙토메닝 조직을 조각으로 자릅니다.</li>
</ol>4. 렙토메닝 효소 소화
<ol><li>효소 혼합물 10mL(단계 1.2)를 단편에 첨가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 조각이 튜브 바닥에서 분리되도록 부드럽게 저어줍니다. 그 후, 10mL의 정지 완충액(1.4단계)을 추가하여 분해를 중단시킵니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>콜드 PBS 10mL를 넣고 혼합물을 70μm 스트레이너를 통해 멸균 50mL 튜브에 통과시켜 덩어리를 걸러냅니다.</li>
</ol>5. 세포 확장
<ol><li>1 x 10 cm당 5개 세포를 5mL의 배양 배지로 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크(2단계)에 플레이트 2개로 만듭니다.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2 로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
	<li>이틀에 한 번씩 배지의 50%를 교체하여 배양을 유지합니다. 이 과정을 두세 번 반복한다.</li>
</ol>6. 마그네틱 셀 선택
알림: 신속하게 작업하고, 셀 냉각을 유지하고, 사전 냉각된 용액을 활용하여 비특이적 셀 라벨링을 방지합니다.
<ol><li>기기 및 시약 준비: 자기 분리기를 자기 분리기 스탠드에 부착합니다( 재료 표 참조). 선택 컬럼을 자기 분리기에 연결하고 70μm 셀 스트레이너를 선택 컬럼 위에 배치합니다. 선택 컬럼 아래에 50mL 튜브를 놓아 흐름을 수집합니다.</li>
	<li>효소 분해: 세포가 80% 합류에 도달하면 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 헹굽니다. 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 중지 버퍼를 추가하여 분해를 중지합니다. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>항체 배양: 100μL의 PBS에 1 x 107 개의 총 세포를 재현탁시키고 10μL의 LYVE-1 항체를 추가합니다( 재료 표 참조). 잘 섞고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.<ol><li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 버립니다. PBS 1mL를 주입하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 헹굽니다. 상층액을 완전히 제거하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로비즈 라벨링: 100μL의 PBS에 세포를 재현탁시키고 20μL의 마이크로비즈를 추가합니다( 재료 표 참조). 잘 섞고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.<ol><li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 디캔팅합니다. 그 후, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리를 통해 PBS 1mL로 세포를 세척합니다. 마지막으로 상층액을 완전히 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>자기 음성 배제: 4mL의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다. 70μm 셀 스트레이너에 세포를 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 선택 컬럼( 재료 표 참조)을 3mL의 PBS로 헹구어 준비한 다음 셀 현탁액을 선택 컬럼에 적용합니다.<ol><li>3mL의 PBS로 세척 단계를 수행하고 LYVE-1-음성 세포를 선택 컬럼 아래에 위치한 50mL 튜브에 수집하여 통과시킬 수 있도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>자기 양성 선택: PBS 6mL를 선택 컬럼에 피펫팅합니다. 플런저를 선택 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 세포를 즉시 플러시하여 LYVE-1 양성 LLEC를 얻습니다. 알림: 다음 단계로 진행하기 전에 항상 선택 열 저장소가 비워질 때까지 기다리십시오.</li>
</ol>7. LLEC의 문화
<ol><li>LYVE-1 양성 LLEC를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>1 x 10cm당 5개 세포를 5mL의 배양 배지가 있는 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크에 2개 플레이트로 만듭니다.</li>
	<li>이틀에 한 번씩 배지의 50%를 교체하여 배양을 유지합니다. 세포가 80% 합류에 도달하면 0.25% 트립신으로 세포를 분리하고 세포 통과를 수행합니다. 2-3 통과 후 후속 실험을 위해 세포를 활용하십시오.</li>
</ol>8. 유세포 분석
참고: 유세포 분석은 앞서 설명한 절차15에 따라 수행되었습니다.
<ol><li>0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 중지 버퍼를 추가하여 소화를 중지합니다.</li>
	<li>세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 완전히 흡인합니다. 1 x 106 세포를 100 μL의 PBS에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>LYVE-1 항체 1μL를 추가합니다. 잘 섞고 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>유세포 분석 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 적절한 양의 PBS 완충액에 세포를 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>9. 면역형광 염색
참고: 면역형광 염색은 앞서 설명한 절차에 따라수행되었습니다 16.
<ol><li>PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 실온에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 10분 동안 고정합니다. PFA를 버리고 PBS로 세포를 세 번 씻습니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 블록 버퍼를 적용합니다. 커버슬립에서 블록 버퍼를 제거합니다.</li>
	<li>염색 완충액의 LYVE-1 항체를 세포에 추가하고 어두운 곳에서 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척합니다.</li>
	<li>염색 완충액에 적절한 2차 항체( 재료 표 참조)를 세포에 추가하고 어두운 곳에서 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척합니다.</li>
	<li>4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색. 이제 세포는 면역형광 현미경 검사를 받을 준비가 되었습니다.</li>
</ol>

Magnetic Cell Selection을 사용한 In Vitro LLEC 배양 확립

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없음을 선언합니다.

시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 이전에 보고된 적이 없습니다. 이 연구는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 재현 가능한 다중 절차 프로토콜을 소개합니다.
이 다중 절차 프로토콜은 재현 가능하지만 몇 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 예를 들어, 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크는 비부착 세포를 제거함으로써 LLEC의 ?...

새로 발견된 렙토메닝 림프 내피 세포(LEC)는 렙토메닝 내에서 개별 세포의 그물망을 형성하여 말초 림프 내피 세포와 비교할 때 뚜렷한 분포 패턴을 나타냅니다 1,2. LLEC와 관련된 세포 기능 및 임상적 의미는 여전히 미지의 영역으로 남아 있습니다. LLEC에 대한 기능적 연구의 길을 닦기 위해서는 연구를 위한 체외 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 따라서 본 연구는 LLEC의 격리 및 1차 배양에 대한 포괄적인 프로토콜을 고안했습니다.
마우스는 질병 연구에서 유전자 조작에 적합하기 때문에 선호되는 동물 모델입니다. 이전 연구에서는 림프절3, 장간막 조직4, 피부 조직5, 수집 림프관6 및 폐 조직7을 포함한 다양한 마우스 조직에서 림프 내피 세포를 성공적으로 분리했습니다. 이러한 분리 절차는 주로 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 유세포 분석분류 8,9,10과 같은 기술에 의존해 왔습니다. 또한, 연구 노력은 쥐 거미막 세포주와 쥐 림프 모세관 세포주11,12의 확립으로 이어졌습니다. 렙토메닝(leptomeninges)에 대한 외식물 배양 기법이 존재함에도 불구하고(13), LLEC의 분리 및 배양을 위한 표준화된 프로토콜이 시급히 필요하다. 결과적으로 이 연구는 현미경의 유도 하에 렙토메닝을 꼼꼼하게 해리하고 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)를 사용하여 LLEC의 확장을 촉진하여 LLEC를 성공적으로 수확 및 배양했습니다. 림프 내피 세포의 독특한 표지자는 림프관 히알루론산 수용체-1(lyve-1)입니다14. 이 다단계 프로토콜은 MACS를 사용하여 LYVE-1 양성 LLEC를 선택적으로 분리한 후 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 순도를 검증합니다.
이 다단계 프로토콜의 주요 단계는 플라스크 코팅, 렙토메닝의 해리, 렙토메닝의 효소 분해, 세포 확장, 자기 세포 선택 및 LLEC의 후속 배양으로 요약할 수 있습니다. 마지막으로, 분리된 LLEC의 순도는 유세포 분석 및 면역형광 염색을 통해 확인됩니다. 이 연구의 가장 중요한 목표는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 분리하고 후속 시험관 내 배양을 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이 프로토콜은 LLEC의 세포 기능 및 임상적 영향에 대한 조사를 크게 촉진할 준비가 되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

연수막 림프 내피 세포(LEC)는 최근에 발견된 두개내 세포 집단으로, 말초 림프 내피 세포와 명확하게 구별되는 독특한 분포를 가지고 있습니다. 그들의 세포 기능과 임상적 의미는 거의 알려지지 않았습니다. 결과적으로, LLEC의 공급은 체외에서 기능적 연구를 수행하는 데 필수적입니다. 그러나 현재 시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 없습니다.
이 연구는 플라스크를 피브로넥틴으로 코팅하고, 현미경을 사용하여 렙토메닝을 해부하고, 렙토메닝을 효소로 소화하여 단세포 현탁액을 준비하고, 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)로 LLEC의 확장을 유도하고, 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 림프관 히알루론산 수용체-1(LYVE-1) 양성 세포를 선택하는 등 다단계 프로토콜을 사용하여 LLEC를 성공적으로 수확했습니다. 이 과정은 궁극적으로 1차 문화의 확립으로 이어졌다. LLEC의 순도는 면역형광 염색 및 유세포 분석을 통해 확인되었으며, 순도는 95%를 초과했습니다. 이 다단계 프로토콜은 재현성과 타당성을 입증했으며, 이는 LLEC의 세포 기능 및 임상적 의미에 대한 탐구를 크게 촉진할 것입니다.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

저자 스포트라이트: 연수막 림프 내피 세포의 세포 기능 및 잠재적 임상적 영향 밝혀내기 

연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

이 연구는 생쥐에서 림프 내피 세포(LEC)를 채취한 후 시험관 내에서 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시합니다. 주요 단계에는 플라스크 준비 및 피브로넥틴 코팅, 렙토메닝의 해리, 효소 분해를 통한 단세포 현탁액 획득, VEGF-C로 LLEC 확장 유도가 포함됩니다. 그런 다음 LYVE-1 양성 LLEC를 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 선택적으로 분리합니다. 마지막으로, ...

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최근에 확인된 두개내 세포 유형인 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 기능이 잘 이해되지 않습니다. 이 연구는 마우스에서 LLEC를 수확하고 시험관 내 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 LLEC의 세포 기능과 잠재적인 임상적 영향을 탐구할 수 있도록 설계되었습니다.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

이 프로토콜은 다른 연구자들에 의해서만 관심이 있는 영역과 문화적 1차 영역에 대한 다중 절차를 확립하기 위해 고안되었습니다 우리의 프로토콜은 궁극적으로 95%를 초과하는 순도 수준을 가진 지역 CS의 1차 배양을 확립하도록 이끌었습니다현재 수확 및 재배를 위한 기존 프로토콜은 없습니다 우리의 결과는 가상에서 LLECS의 유사한 기능을 추가로 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 최근 발견된 RUC에서 두개내 세포 집단, RUC의 생물학적 중요성 세포 기능에 대한 추가 연구를 수행하고 임상적 의미를 검토할 것입니다.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

868 조회수.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. 이 프로토콜은 다른 연구자들에 의해서만 관심이 있는 영역과 문화적 1차 영역에 대한 다중 절차를 확립하기 위해 고안되었습니다 우리의 프로토콜은 궁극적으로 95%를 초과하는 순도 수준을 가진 지역 CS의 1차 배양을 확립하도록 이끌었습니다현재 수확 및 재배를 위한 기존 프로토콜은 없습니다 우리의 결과는 가상에서 LLECS의 유사한 기능을 추가로 조사할 수 있는 길을 열?...

비디오: 저자 스포트라이트: 연수막 림프 내피 세포의 세포 기능 및 잠재적 임상적 영향 밝혀내기 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

연구

신경과학

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

마우스 렙토메닝 분해 및 효소 분해를 위한 연수막 세포의 효율적인 배양

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.