המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226, 81760223), הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045, 202301AY070001-011), וקרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2023Y0784).

מחקר זה קיבל אישור מוועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית של קונמינג (kmmu20220945). כל הניסויים עמדו בהנחיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים. תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs) נלקחו מעכברים זכרים C57Bl/6J בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל בין 20-25 גרם. עכברים אלה נרכשו מהאוניברסיטה הרפואית של קונמינג בקונמינג, סין. ההליך הניסיוני כולו נערך בתנאים סטריליים קפדניים. כל שלבי הצנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
1. הכנת ריאגנטים ומכשירים
הערה: כל השלבים הכוללים פתרונות חייבים להתבצע בתוך ארון סיכונים ביולוגיים סוג II.
<ol><li>הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב מלח חוצץ פוספט (PBS) עם סידן ומגנזיום, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים). שמור על חיץ זה קר ב 4 °C. חשוב להכין אותו טרי ביום השימוש ולנטרל את החיץ.</li>
	<li>הכינו את אנזימי העיכול על ידי שילוב של 10 מ"ל PBS (ללא סידן ומגנזיום) עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, 1 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל פפאין, ו-200 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז I (ראו טבלת חומרים). הערה: הקפד להשתמש ב- aliquots של אמצעי אחסון מתאימים כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. אחסן aliquots אלה ב -20 °C.</li>
	<li>הכינו את מדיום התרבית על ידי שימוש בערכת מדיום גידול תאי אנדותל הזמינה מסחרית, הכוללת VEGF-C (100 ננוגרם/מ"ל) ו-1% P/S (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הכינו את מאגר העצירה על ידי השלמת מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 10% FBS כדי לעצור את תהליך העיכול.</li>
	<li>הכינו כלי ניתוח סטריליים: מכשירים אלה צריכים לכלול מספריים, פינצטה משוננת ופינצטה עדינה.</li>
</ol>2. ציפוי בקבוקון
<ol><li>מצפים את בקבוק T25 בתמיסת פיברונקטין 100 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים) ודגרים למשך הלילה ב-37°C. לפני השימוש יש להסיר את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.</li>
	<li>שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן שאפו את PBS, ואפשרו לבקבוק T25 להתייבש באוויר.</li>
</ol>3. דיסוציאציה Leptomeninges
הערה: השתמש תמיד במאגרים ותמיסות מקוררים מראש בטמפרטורה של 4°C.
<ol><li>מרדימים את העכברים בשאיפה עודפת של 4% איזופלורן ולאחר מכן מקריבים אותם על ידי עריפת ראש מהירה באמצעות מספריים שנוקו בעבר עם 70% אתנול.</li>
	<li>יש לחתוך בזהירות את העור לאורך קו האמצע, החל מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת ועד לאזור הקדמי.</li>
	<li>הסר בעדינות את הגולגולת, הרים אותה בעדינות עם המספריים כדי למנוע נזק leptomeninges, להבטיח את המוח כולו, כולל leptomeninges, מתקבל.</li>
	<li>השקיעו את כל המוח במאגר כביסה ושטפו אותו בעדינות כדי להסיר דם משטח.</li>
	<li>מעבירים את המוח לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, ומחלצים את הלפטומנינגים מפני השטח של המוח באמצעות פינצטה עדינה תחת מיקרוסקופ.</li>
	<li>חותכים את רקמת הלפטומנינגס לשברים באמצעות מיקרו-מספריים סטריליים.</li>
</ol>4. Leptomeninges עיכול אנזימטי
<ol><li>מוסיפים 10 מ"ל של תערובת האנזימים (שלב 1.2) למקטעים ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. יש להתסיס בעדינות כדי להבטיח שהשברים יתנתקו מתחתית הצינור. לאחר מכן, להוסיף 10 מ"ל של חיץ עצירה (שלב 1.4) כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה.</li>
	<li>מוסיפים 10 מ"ל PBS קר, ומעבירים את התערובת דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי של 50 מ"ל כדי לסנן את כל הגושים.</li>
</ol>5. הרחבת תאים
<ol><li>צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ 2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין (שלב2) עם5 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות. לאחר מכן, הסר את המדיום כדי לחסל תאים שאינם מחוברים.</li>
	<li>לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.</li>
</ol>6. בחירת תאים מגנטיים
הערה: עבוד במהירות, שמור על קור התאים והשתמש בתמיסות מקוררות מראש כדי למנוע תיוג תאים לא ספציפי.
<ol><li>הכנת מכשירים וריאגנטים: מחברים מפריד מגנטי למעמד מפריד מגנטי (ראה טבלת חומרים). חבר עמודת בחירה למפריד המגנטי ומקם מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר על גבי עמודת הבחירה. מקם צינור של 50 מ"ל מתחת לעמודת הבחירה כדי לאסוף את הזרימה.</li>
	<li>עיכול אנזימטי: ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, שואפים את התווך ושוטפים את התאים עם PBS. הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת מאגר העצירה. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>דגירה של נוגדנים: להשהות מחדש 1 x 107 תאים סה"כ ב 100 μL של PBS ולהוסיף 10 μL של נוגדן LYVE-1 (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב-18 מעלות.<ol><li>סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. שטוף את התאים על ידי החדרת 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.</li>
	</ol></li>
	<li>תיוג מיקרו-כדוריות: יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 20 מיקרו-כדוריות (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב ודגרים במשך 30 דקות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס.<ol><li>סובבו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו decant את supernatant. לאחר מכן, לנקות את התאים עם 1 מ"ל של PBS באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לבסוף, להסיר לחלוטין את supernatant.</li>
	</ol></li>
	<li>הרחקה שלילית מגנטית: להשעות מחדש את התאים ב 4 מ"ל של PBS. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק גושים. הכינו את עמודת הבחירה (ראו טבלת חומרים) על-ידי שטיפתה ב-3 מ"ל PBS, ולאחר מכן החילו את תרחיף התא בעמודת הבחירה.<ol><li>בצעו שלבי שטיפה עם 3 מ"ל PBS ואספו תאים שליליים מסוג LYVE-1 לתוך צינור של 50 מ"ל הממוקם מתחת לעמודת הבחירה כדי לאפשר להם לעבור.</li>
	</ol></li>
	<li>בחירה חיובית מגנטית: פיפטה 6 מ"ל של PBS לתוך עמודת הבחירה. שטוף באופן מיידי את התאים המסומנים מגנטית על-ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך עמודת הבחירה כדי לקבל LLECs חיוביים ל-LYVE-1. הערה: המתן תמיד עד שמאגר עמודת הבחירה יתרוקן לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
</ol>7. תרבות LLECs
<ol><li>צנטריפוגו את ה-LLECs החיוביים ל-LYVE-1 ב-300 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נטנט.</li>
	<li>צלחת 1 x 10 5 תאים לס"מ2 לתוך בקבוק T25 מצופה פיברונקטין עם5 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
	<li>לשמור על התרבות על ידי החלפת 50% של המדיום כל יומיים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%, מנתקים את התאים עם 0.25% טריפסין ומבצעים מעבר תאים. נצלו את התאים לניסויים הבאים לאחר 2-3 מעברים.</li>
</ol>8. ניתוח ציטומטרי זרימה
הערה: הניתוח הציטומטרי של Flow נערך בעקבות הליך15 שתואר קודם לכן.
<ol><li>הוסיפו 0.25% טריפסין כדי לנתק תאים דבקים ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף את מאגר העצירה כדי לעצור את העיכול.</li>
	<li>צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות לחלוטין לשאוף את supernatant. השהה מחדש 1 x 106 תאים ב 100 μL של PBS.</li>
	<li>הוסף 1 μL של נוגדן LYVE-1. מערבבים היטב ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים בכמות מתאימה של מאגר PBS לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה ותוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>9. צביעה אימונופלואורסצנטית
הערה: הצביעה האימונופלואורסצנטית בוצעה בעקבות ההליך שתואר קודם לכן16.
<ol><li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-PFA ושטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים.</li>
	<li>החל את מאגר הבלוקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר הבלוקים מהכיסויים.</li>
	<li>מוסיפים את נוגדן LYVE-1 במאגר הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן משני מתאים (ראו טבלת חומרים) בחיץ הצביעה לתאים ודגרים בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>כתם נגדי עם 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). התאים מוכנים כעת למיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי.</li>
</ol>

הקמת תרביות LLEC חוץ גופיות באמצעות בחירת תאים מגנטיים

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+bovine+mesenteric+lymphatic+endothelium.">Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium.</a> In vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Jablon, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים לחשוף.

הפרוטוקול הקיים לקציר וגידול LLECs במבחנה לא דווח בעבר. מחקר זה מציג פרוטוקול רב-פרוצדורלי הניתן לשחזור לקציר וגידול LLECs מלפטומינינגים של עכברים.
בעוד פרוטוקול רב-פרוצדורלי זה ניתן לשחזור, ישנם מספר שיקולים מרכזיים. לדוגמה, צלוחיות T25 מצופות פיברונקטין מקדמות הידבקות של L...

תאי אנדותל לימפה לפטומנינגיאליים שהתגלו לאחרונה (LLECs) יוצרים רשת של תאים בודדים בתוך הלפטומנינגים, ומציגים דפוס התפלגות מובהק בהשוואה לתאי אנדותל לימפטיים היקפיים 1,2. התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות הקשורות ל-LLECs נותרו במידה רבה טריטוריה לא ממופת. על מנת לסלול את הדרך למחקר פונקציונלי על LLECs, הכרחי להקים מודל in vitro עבור המחקר שלהם. לכן, מחקר זה פיתח פרוטוקול מקיף לבידוד ותרבות ראשונית של LLECs.
עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל התאמתם למניפולציה גנטית בחקר מחלות. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה תאי אנדותל לימפטיים מרקמות עכבר שונות, כולל בלוטות לימפה3, רקמה מזנטרית4, רקמת עור5, איסוף לימפה6 ורקמת ריאה7. הליכי בידוד אלה הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) ומיון ציטומטריית זרימה 8,9,10. בנוסף, מאמצי המחקר הובילו להקמת קווי תאים ארכנואידים של חולדות וקווי תאי נימים לימפטיים של חולדות11,12. למרות קיומן של טכניקות תרבית צמחים עבור לפטומנינגה13, קיים צורך דחוף בפרוטוקול סטנדרטי לבידוד ותרבית של LLECs. כתוצאה מכך, מחקר זה הצליח לקצור ולתרבת LLECs על ידי ניתוק קפדני של לפטומנינגים בהנחיית מיקרוסקופ וקידום הרחבת LLECs באמצעות שימוש בגורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C). הסמן הייחודי לתאי אנדותל לימפטיים הוא קולטן היאלורוני של כלי הלימפה-1 (LYVE-1)14. פרוטוקול רב-שלבי זה מבודד באופן סלקטיבי LLECs חיוביים ל-LYVE-1 באמצעות MACS ולאחר מכן מוודא את טוהרם באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
ניתן לסכם את השלבים העיקריים של פרוטוקול רב-שלבי זה באופן הבא: ציפוי בקבוקים, דיסוציאציה של לפטומנינגים, עיכול אנזימטי של לפטומנינגים, התפשטות תאים, בחירת תאים מגנטיים ותרבית עוקבת של LLECs. לבסוף, טוהר ה- LLECs המבודדים מאושר באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה וצביעה אימונופלואורסצנטית. מטרת העל של מחקר זה היא להציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לבידוד LLECs מלפטומינינגים של עכברים ומתרבית המבחנה שבאה בעקבותיהם. פרוטוקול זה צפוי להקל מאוד על חקירת התפקודים התאיים וההשלכות הקליניות של LLECs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

תאי אנדותל לימפטיים לפטומנינגיאליים (LLECs) הם אוכלוסיית תאים תוך-גולגולתיים שהתגלתה לאחרונה עם תפוצה ייחודית הנבדלת בבירור מתאי אנדותל לימפטיים היקפיים. תפקודם התאי והשלכותיהם הקליניות עדיין אינם ידועים במידה רבה. כתוצאה מכך, הזמינות של אספקת LLECs חיונית לביצוע מחקר פונקציונלי במבחנה. עם זאת, אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול LLECs במבחנה.
מחקר זה אסף בהצלחה LLECs באמצעות פרוטוקול רב-שלבי, שכלל ציפוי הבקבוק בפיברונקטין (FIBRONECTIN), ניתוח הלפטומנינגים בעזרת מיקרוסקופ, עיכול אנזימטי של הלפטומנינגים כדי להכין תרחיף חד-תאי, גרימת התרחבות של LLECs עם גורם גדילה אנדותל כלי דם-C (VEGF-C), ובחירת תאים חיוביים קולטן היאלורוני של כלי הלימפה -1 (LYVE-1) באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תהליך זה הוביל בסופו של דבר לכינונה של תרבות ראשונית. טוהר ה- LLECs אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית וניתוח ציטומטרי זרימה, עם רמת טוהר העולה על 95%. פרוטוקול רב-שלבי זה הוכיח יכולת שחזור והיתכנות, אשר יקלו מאוד על חקר התפקוד התאי וההשלכות הקליניות של LLECs.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

מחבר זרקור: חשיפת תפקודים תאיים והשלכות קליניות פוטנציאליות של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal 

קציר ותרבית ראשונית של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

מחקר זה מציג פרוטוקול רב-שלבי הניתן לשחזור לקצירת תאי אנדותל לימפטיים (LLECs) מעכברים ולאחר מכן לביסוס התרבית הראשונית שלהם במבחנה. שלבי המפתח כוללים הכנת בקבוקים וציפוי פיברונקטין (fibronectin), דיסוציאציה של לפטומנינגים, השגת תרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי, וגרימת הרחבת LLECs עם VEGF-C. לאחר ...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling Cellular Functions and Potential Clinical Implications of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal (LLECs), סוג תא תוך גולגולתי שזוהה לאחרונה, הם בעלי תפקידים לא מובנים. מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לקצירת LLECs מעכברים וביסוס תרביות ראשוניות במבחנה . פרוטוקול זה נועד לאפשר לחוקרים להתעמק בתפקודים התאיים ובהשלכות הקליניות האפשריות של LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

פרוטוקול זה מיועד לאזורים של חוקרים אחרים המעוניינים רק היכן שנקבע ההליך הרב-פרוצדורתי לאזורים ראשוניים תרבותיים הפרוטוקול שלנו הוביל בסופו של דבר לביסוס התרבות העיקרית שלנו של אזור CS עם רמת טוהר העולה על 95%אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול התוצאות שלנו סללו את הדרך לחקירה נוספת של הפונקציה הדומה של LLECS בווירטואלי. ב- RUC, התגלית האחרונה שלנו על אוכלוסיית תאים תוך גולגולתית, המשמעות הביולוגית של RUC נערוך מחקר נוסף על תפקוד התא ונסקור את השלכותיו הקליניות.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

873 Views.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. פרוטוקול זה מיועד לאזורים של חוקרים אחרים המעוניינים רק היכן שנקבע ההליך הרב-פרוצדורתי לאזורים ראשוניים תרבותיים הפרוטוקול שלנו הוביל בסופו של דבר לביסוס התרבות העיקרית שלנו של אזור CS עם רמת טוהר העולה על 95%אין כיום פרוטוקול קיים לקציר וגידול התוצאות שלנו סללו את הדרך לחק...

Video: מחבר זרקור: חשיפת תפקודים תאיים והשלכות קליניות פוטנציאליות של תאי אנדותל לימפטיים Leptomeningeal 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.