د. د. و س. م. د. الاعتراف بمنحة BMBF "CellWiTaL: أنظمة الخلايا القابلة للتكرار لأبحاث الأدوية - نقل الطباعة بالليزر الخالية من الطبقات لخلايا مفردة محددة للغاية في هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد" الاقتراح رقم 13N15874. D.D. و V.R.A. تعترف بمنحة EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "التدريب الشامل للجيل القادم من أبحاث هشاشة العظام" GA Nr. 101034412. ويعرب جميع المؤلفين عن تقديرهم للسيدة بيت غيير لما قدمته من مساعدة تقنية.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات باستخدام تقنيات التعقيم.
1. الثقافة والتوسع المسبق ل NHDFs
<ol><li>قم بإذابة قارورة التبريد التي تحتوي على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية المحفوظة بالتبريد (NHDFs ، 1 × 106 خلايا) بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى تكاد تذوب الجليد.</li>
	<li>أضف ببطء 1 مل من وسط نمو الخلايا الليفية المسخنة مسبقا 2 (مجموعة جاهزة للاستخدام بما في ذلك الوسط القاعدي ، مصل ربلة الساق الجنيني 2٪ (FCS) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) والأنسولين) مع 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا (NHDF متوسط) ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية إلى الخلايا.</li>
	<li>نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>إزالة الطاف. أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من وسط NHDF المسخن مسبقا.</li>
	<li>انقل الخلايا إلى قارورة T-75 واهتز لفترة وجيزة بطريقة متقاطعة. ضع قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .</li>
	<li>تغيير المتوسطة كل 2 أيام. راقب NHDFs تحت المجهر حتى تصل إلى التقاء 70٪ - 80٪.</li>
</ol>2. توسيع 2D
<ol><li>أخرج قارورة T-75 للحاضنة وأزل وسط NHDF. اغسل الخلايا بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS).</li>
	<li>أضف 3 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA إلى الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 حتى تنفصل الخلايا عن القارورة (حوالي 3 دقائق).</li>
	<li>أضف 6 مل من وسط NHDF المسخن مسبقا لتحييد عمل التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT وإزالة الطاف.</li>
	<li>أعد تعليق حبيبات الخلايا في وسط النسور المعدلة (DMEM) منخفض الجلوكوز من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، 1x أحماض أمينية MEM ، 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>طبق NHDFs في طبق زراعة الخلايا الملتصقة 10 سم بكثافة 8 × 103 NHDFs / سم2 (في المجموع ، 4.4 × 105 NHDFs لكل طبق 10 سم). صخرة بلطف بطريقة متقاطعة.</li>
	<li>ضع طبق زراعة الخلايا 10 سم على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 . تغيير الوسيط كل 2 أيام</li>
	<li>راقب الخلايا تحت المجهر حتى تصل إلى التقاء 100٪ (حوالي 5 أيام).</li>
</ol>3. تحفيز 2D
<ol><li>أخرج أطباق زراعة الخلايا 10 سم التي تحتوي على NHDFs (من الخطوتين 2.6 و 2.7) من الحاضنة. قم بإزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا.</li>
	<li>أضف 10 مل من وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS و 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك و 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ضع طبق بتري على حرارة 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . تغيير المتوسطة كل 2 أيام.</li>
	<li>مراقبة NHDFs تحت المجهر لمدة 14 يوما.</li>
</ol>4. 3D النضج
<ol><li>أخرج طبق زراعة الخلايا 10 سم من الحاضنة وأزل وسط الجلوكوز العالي DMEM.</li>
	<li>افصل ورقة الخلية المشكلة برفق وبسرعة عن الطبق باستخدام مكشطة خلية. أثناء الانفصال ، قم بلف ورقة الخلية في وقت واحد إلى عضوي يشبه قضيب 3D.</li>
	<li>التقط وضع عضويات NHDF في طبق بتري غير ملتصق (للخلايا) بطول 10 سم. يستخدم هذا النوع من الأطباق لتجنب هجرة الخلايا من العضو العضوي إلى البلاستيك.</li>
	<li>في هذه النقطة الزمنية أو بعد يوم واحد (اليوم 0 أو اليوم 1 من النضج ثلاثي الأبعاد) ، اجمع بعض الكائنات العضوية لمزيد من التحليلات مثل الوزن الرطب والتقييم النسيجي (يفضل استخدام المواد العضوية في اليوم 1 لأنها تصبح أكثر إحكاما) والحمض النووي الريبي وعزل البروتين.</li>
	<li>إصلاح حواف العضو العضوي مع دبابيس معدنية على النحو التالي:<ol><li>امسك جانبا واحدا من العضو العضوي بعناية باستخدام ملقط ، وباستخدام ملقط آخر ، قم بتطبيق التمدد اليدوي برفق بنسبة 10٪ تقريبا من الاستطالة المحورية. لتقدير الاستطالة المحورية بنسبة 10٪ ، استخدم ورقة ملليمتر أو مسطرة.</li>
		<li>بعد ذلك ، التقط دبوسا معدنيا واحدا باستخدام الملقط واضغط يدويا لأسفل من خلال الحافة العضوية في الطبق البلاستيكي لإصلاحه. كرر هذا الإجراء مع الدبوس الثاني على الحافة الثانية من العضو العضوي.</li>
	</ol></li>
	<li>أضف 10 مل من وسط DMEM عالي الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS ، 1x أحماض أمينية MEM ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 نانوغرام / مل TGFß3 ، و 1٪ قلم / بكتيريا ، مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ضع طبق 10 سم على حرارة 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . تغيير المتوسطة كل 2 أيام.</li>
	<li>راقب المواد العضوية بانتظام لمدة 14 يوما. ملاحظة: قد ترتخي الدبابيس ، وبالتالي إعادة الإصلاح باستخدام نفس الأسلوب الموضح في الخطوة 4.5.</li>
	<li>بعد 14 يوما ، قم بإزالة وسط الجلوكوز العالي DMEM من المواد العضوية. اغسل المواد العضوية باستخدام برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا.</li>
	<li>قم بقياس المواد العضوية للوزن الرطب في اليوم 0 واليوم 14 باستخدام مقياس دقيق.<ol><li>ضع طبقا فارغا طوله 10 سم على الميزان واجعل الوزن صفرا لضمان قياس وزن الكائنات العضوية فقط. قم بإزالة وسط الاستزراع بالكامل من طبق 10 سم وقم بقياس الوزن الرطب العضوي واحدا تلو الآخر. ملاحظة: في هذه الدراسة ، في اليوم 0 ، تم وزن ثلاثة عضويات لكل متبرع ، وفي اليوم 14 ، تم وزن عضوين لكل متبرع.</li>
	</ol></li>
	<li>وفقا لأغراض الدراسة ، قم بتنفيذ بعض المواد العضوية NHDF في مزيد من التحليلات النسيجية أو قم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل باستخدام أنابيب معقمة خالية من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين اللاحق ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية.</li>
	<li>للتحقيق النسيجي ، ثبت كل عضو عضوي في 5 مل من بارافورمالدهيد المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) 4٪ في PBS (معدل إلى درجة الحموضة المحايدة) لمدة 45 دقيقة على الجليد ، متبوعا بغسل PBS في RT (2 × 5 دقائق لكل منهما).</li>
	<li>قم بحماية المواد العضوية الثابتة بالتبريد باستخدام تدرج السكروز عن طريق وضع الكائنات العضوية في عبوات زجاجية للأنسجة. احتضان المواد العضوية في 10٪ سكروز في محلول PBS لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، بعد 20٪ سكروز / PBS لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية ، وأخيرا ، 30٪ سكروز / PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير محاليل السكروز عن طريق سحب المحلول أولا ثم ملئه بالمحلول الجديد.</li>
	<li>قم بتضمين المواد العضوية في وسط التبريد.<ol><li>ضع طبقا نحاسيا على ثلج جاف في صندوق الستايروفوم واتركه يبرد لمدة 10 دقائق.</li>
		<li>بعد ذلك ، ضع قالب تبريد بلاستيكي ، مملوء مسبقا بوسط التبريد ، على الصفيحة النحاسية واضغط برفق على العضو العضوي في أسفل cryomold باستخدام الملقط. انتظر حتى يتم تجميد cryomedium بالكامل.</li>
		<li>بالنسبة للمواد العضوية الطويلة ، قم أولا بقصها إلى نصفين بمشرط ووضع النصفين بالتوازي مع بعضهما البعض في cryomold. كرر الإجراء لكل عضوي يهدف إلى الخضوع للتحليل النسيجي.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستئصال بالتبريد.</li>
	<li>باستخدام cryotome ، قم بقطع المواد العضوية طوليا في أقسام بسمك 10 ميكرومتر وتخضع للتلطيخ النسيجي مثل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) باستخدام البروتوكول القياسي8.</li>
</ol>

نموذج عضوي من ثلاث خطوات لأبحاث وهندسة الأوتار

<ol>
	<li>Schneider, M., Angele, P., J&#228;rvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+plan+for+Achilles:+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing.">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li><li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+tendon+pathologies:+Triggers,+trails+and+end-state.">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).</li><li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy.">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li><li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments.">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li><li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendon+microenvironment:+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk.">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).</li><li>Docheva, D., M&#252;ller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologics+for+tendon+repair.">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li><li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model.">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).</li><li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model.">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li><li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+tendon+stem/progenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits.">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).</li><li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li><li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly.">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li><li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep.">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li><li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered,+scaffold-free+tendon+fibers.">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem/progenitor+cells+for+tendon+repair.">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).</li><li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+tendons:+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts.">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047 (2020).</li><li>Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+cell-based+therapies+for+tendon+repair.">Progress in cell-based therapies for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-&#946;+and+elongated+cell+shape.">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-&#946; and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li><li>Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., D&#252;nker, N., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+maintenance+of+tendon+progenitors+by+TGFbeta+signaling+are+essential+for+tendon+formation.">Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation.</a> Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).</li><li>Pattappa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physioxia+has+a+beneficial+effect+on+cartilage+matrix+production+in+interleukin-1+beta-inhibited+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis.">Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Cells. 8 (8), 936 (2019).</li><li>Shafiee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+physiologically+relevant+skin+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Small. 2304879, (2023).</li><li>Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+dish+makes+a+difference:+quantitative+comparison+of+polystyrene+culture+surfaces.">Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces.</a> Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).</li><li>Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+mechanics+of+thin+and+thick+composite+T-joints+reinforced+with+z-pins.">Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins.</a> Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).</li><li>Gelberman, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+ASCs+and+BMP-12+promotes+an+M2+macrophage+phenotype+and+enhances+tendon+healing.">Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing.</a> Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

توفر النتائج الموضحة في هذه الدراسة رؤى قيمة حول إنشاء وتوصيف نموذج NHDF 3D العضوي لدراسة أنسجة T / L. أدى البروتوكول المكون من 3 خطوات إلى تكوين عضويات تشبه قضيب ثلاثي الأبعاد تظهر ميزات نموذجية لمكانة T / L. تم الإبلاغ عن هذا النموذج سابقا في Kroner-Weigl et al. 20237 وتم عرضه بتفصيل كبير ?...

الأوتار والأربطة (T / L) هي مكونات حيوية للجهاز العضلي الهيكلي التي توفر الدعم الأساسي والاستقرار للجسم. على الرغم من دورها الحاسم ، فإن هذه الأنسجة الضامة عرضة للانحطاط والإصابة ، مما يسبب الألم وضعف الحركة1. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي إمدادهم المحدود بالدم وقدرتهم البطيئة على الشفاء إلى إصابات مزمنة ، في حين أن عوامل مثل الشيخوخة والحركة المتكررة وإعادة التأهيل غير السليمة تزيد من خطر التنكس والإصابة2. العلاجات التقليدية ، مثل الراحة والعلاج الطبيعي والتدخلات الجراحية ، غير قادرة على استعادة هيكل T / L ووظيفته بالكامل. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سعى الباحثون إلى فهم الطبيعة المعقدة ل T / L بشكل أفضل من أجل البحث عن علاجات فعالة لاضطرابات T / L3،4،5. تتميز T / L بهيكل منظم هرميا تهيمن عليه مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، يتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين من النوع الأول والبروتيوغليكان ، وهي ميزة يصعب تكرارها في المختبر6. تفشل نماذج زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التقاط التنظيم الثلاثي الأبعاد (3D) المميز لأنسجة T / L ، مما يحد من إمكاناتها الانتقالية بالإضافة إلى إعاقة التقدم المبتكر في مجال تجديد T / L.
في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير نماذج 3D العضوية إمكانيات جديدة لتطوير البحوث الأساسية وهندسة الأنسجة الخالية من السقالات من أنواع الأنسجةالمختلفة 7،8،9،10،11،12،13. على سبيل المثال ، للتحقيق في تقاطع الأوتار العضلية ، طور Larkin et al. 2006 تركيبات العضلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع شرائح الأوتار ذاتية التنظيم المشتقة من وتر ذيل الفئران10. علاوة على ذلك ، قام Schiele et al. 2013 ، باستخدام قنوات النمو المغلفة بالفبرونيكتين الدقيقة ، بتوجيه التجميع الذاتي للخلايا الليفية الجلدية البشرية لتشكيل ألياف خلوية دون مساعدة سقالة ثلاثية الأبعاد ، وهو نهج يمكنه التقاط السمات الرئيسية لتطور الأوتار الجنينية11. في الدراسة التي أجراها Florida et al. 2016 ، تم توسيع خلايا انسجة نخاع العظم لأول مرة إلى سلالات العظام والأربطة ، واستخدمت بعد ذلك لتوليد صفائح خلايا أحادية الطبقة مجمعة ذاتيا ، والتي تم تنفيذها بعد ذلك لإنشاء بنية عظمية متعددة الأطوار للأربطة والعظام تحاكي الرباط الصليبي الأمامي الأصلي ، وهو نموذج يهدف إلى تحسين فهم تجديد الرباط12. لتوضيح عمليات النقل الميكانيكي للوتر ، استخدم Mubyana et al. 2018 منهجية خالية من السقالات تم من خلالها إنشاء ألياف وتر واحد وإخضاعها لبروتوكول التحميلالميكانيكي 13. Organoids هي هياكل 3D ذاتية التنظيم تحاكي العمارة الأصلية والبيئة المكروية ووظائف الأنسجة. توفر الثقافات العضوية 3D نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة بيولوجيا الأنسجة والأعضاء وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. يمكن أيضا استخدام هذه النماذج للحث على التمايز الخاص بالأنسجة لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية / السلفية14,15. وبالتالي ، فإن تنفيذ نماذج 3D العضوية في مجال بيولوجيا T / L وهندسة الأنسجة يصبح نهجا جذابا للغاية 9,16. يمكن تنفيذ مصادر الخلايا البديلة لتجميع العضوي وتحفيزها نحو التمايز التينوجيني. أحد أنواع الخلايا ذات الصلة المستخدمة للتوضيح في هذه الدراسة هو الخلايا الليفية الجلدية7،17،18. يمكن الوصول إلى هذه الخلايا بسهولة من خلال إجراء خزعة الجلد ، وهو أقل توغلا مقارنة بثقب نخاع العظم أو شفط الدهون ويمكن مضاعفتها بسرعة إلى حد ما إلى أعداد كبيرة بسبب قدرتها التكاثرية الجيدة. في المقابل ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ، مثل الخلايا الليفية المقيمة T / L ، أكثر صعوبة في العزل والتوسع. لذلك ، تم استخدام الخلايا الليفية الجلدية أيضا كنقطة انطلاق لتقنيات إعادة برمجة الخلايا نحو الخلايا الجذعية الجنينية المستحثةمتعددة القدرات 19. إن إخضاع الخلايا الليفية الجلدية لظروف ثقافة ثلاثية الأبعاد محددة وإشارات إشارات ، مثل تحويل عامل النمو بيتا 3 (TGFß3) ، والذي تم الإبلاغ عن أنه يعمل كمنظم رئيسي للعمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك تكوين وصيانة T / L ، يمكن أن يحفز تمايزها في المختبر مما يؤدي إلى التعبير عن جينات خاصة بالوتر وترسب T / L-typical ECM20 ، 21.
هنا ، نصف ونوضح بروتوكولا عضويا تم إنشاؤه وتنفيذه مسبقا من 3 خطوات (توسع ثنائي الأبعاد ، وتحفيز ثنائي الأبعاد ، ونضج ثلاثي الأبعاد) باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية العادية للبالغين (NHDFs) المتاحة تجاريا كمصدر للخلايا ، مما يقدم نموذجا قيما للدراسة في تكوين الوتر في المختبر 7. على الرغم من حقيقة أن هذا النموذج لا يعادل أنسجة T / L في الجسم الحي ، إلا أنه لا يزال يوفر نظاما أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه للتحقيق في آليات التمايز الخلوي ، ومحاكاة الفيزيولوجيا المرضية T / L في المختبر ، وإنشاء T / L الطب الشخصي ومنصات فحص الأدوية. علاوة على ذلك ، في المستقبل ، يمكن للدراسات تقييم ما إذا كانت المواد العضوية 3D مناسبة لهندسة T / L الخالية من السقالات من خلال مزيد من التحسين وكذلك قابلة للاستخدام لتطوير تركيبات قوية ميكانيكيا موسعة تشبه إلى حد كبير الأبعاد والخصائص الهيكلية والفيزيائية الحيوية لأنسجة T / L الأصلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;&#160;</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm adherent cell culture dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm non-adherent petri dish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-medium</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands&#160;&#160;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold standard&#160;</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose&#160;</td>
			<td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose medium&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>DMEM-HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>DMEM-LPXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>&#160;Anprotec, Bruckberg, Germany&#160;</td>
			<td>AC-SM-0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>C-23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope with high resolution camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Zeiss Axio Observer with&#160; Axiocam 506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>NEAA-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal pins&#160;</td>
			<td>EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic&#160;</td>
			<td>04.31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td>&#160;PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td>C-12302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>&#160;AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;3&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems, Wiesbaden, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;8420-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% DPBS&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;TRY-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of self-assembled cell sheet culture and manual generation of a 3d tendon/ligament-like organoid by using human dermal fibroblasts

الأوتار والأربطة (T / L) هي هياكل قوية منظمة هرميا توحد الجهاز العضلي الهيكلي. تحتوي هذه الأنسجة على مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين من النوع الأول (ECM) وخلايا سلالة T / L مرتبة بشكل أساسي في صفوف متوازية. بعد الإصابة ، يتطلب T / L وقتا طويلا لإعادة التأهيل مع مخاطر فشل عالية ونتائج إصلاح غير مرضية في كثير من الأحيان. على الرغم من التطورات الحديثة في أبحاث بيولوجيا T / L ، فإن أحد التحديات المتبقية هو أن مجال T / L لا يزال يفتقر إلى بروتوكول تمايز موحد قادر على تلخيص عملية تكوين T / L في المختبر. على سبيل المثال ، يتطلب تمايز العظام والدهون لخلايا السلائف الوسيطة فقط زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد القياسية (2D) وإضافة وسائط تحفيز محددة. للتمايز مع الغضاريف ، من الضروري زراعة الحبيبات ثلاثية الأبعاد (3D) ومكملات TGFß. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا إلى الأوتار يحتاج إلى نموذج ثقافة 3D منظم للغاية ، والذي يجب أن يكون مثاليا أيضا خاضعا للتحفيز الميكانيكي الديناميكي. لقد أنشأنا نموذجا عضويا من 3 خطوات (التوسع والتحفيز والنضج) لتشكيل هيكل يشبه قضيب 3D من ورقة خلية مجمعة ذاتيا ، والتي توفر بيئة دقيقة طبيعية مع عوامل ECM و autocrine و paracrine الخاصة بها. تتميز هذه الكائنات العضوية الشبيهة بالقضيب ببنية خلوية متعددة الطبقات داخل ECM الغنية ويمكن التعامل معها بسهولة تامة للتعرض للإجهاد الميكانيكي الثابت. هنا ، أظهرنا البروتوكول المكون من 3 خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية المتاحة تجاريا. يمكننا أن نظهر أن هذا النوع من الخلايا يشكل عضويات قوية ووفيرة من ECM. يمكن تحسين الإجراء الموصوف بشكل أكبر من حيث وسائط الثقافة وتحسينه نحو التحفيز الميكانيكي المحوري الديناميكي. بنفس الطريقة ، يمكن اختبار مصادر الخلايا البديلة لقدرتها على تكوين عضويات T / L وبالتالي الخضوع لتمايز T / L. باختصار ، يمكن استخدام نهج 3D T / L العضوي المعمول به كنموذج للبحوث الأساسية للأوتار وحتى لهندسة T / L الخالية من السقالات.

Tendons and ligaments (T/L) are vital components of the musculoskeletal system that provide essential support and stability to the body. Despite their critical role, these connective tissues are prone to degeneration and injury, causing pain and impairment of mobility1. Moreover, their limited blood supply and slow healing capacity can lead to chronic injuries, whereas factors such as aging, repetitive motion, and improper rehabilitation further increase the risk of degeneration and injury2. Conventional treatments, such as rest, physical therapy, and surgical interventions, are unable to fully restore the T/L structure and function. Over the past few years, researchers have strived to better understand the intricate nature of T/L in order to seek effective treatments for T/L disorders3,4,5. T/L are distinguished by a hierarchically organized, extracellular matrix (ECM)-dominated structure, composed primarily of type I collagen fibers and proteoglycans, a feature that is difficult to be replicated in vitro6. Traditional two-dimensional (2D) cell culture models fail to capture the characteristic three-dimensional (3D) organization of T/L tissues, limiting their translational potential as well as hindering the innovative progress in the field of T/L regeneration.
Recently, the development of 3D organoid models has offered new possibilities for advancing basic research and scaffolds-free tissue engineering of various tissue types7,8,9,10,11,12,13. For example, to investigate myotendinous junction, Larkin et al. 2006 developed 3D skeletal muscle constructs together with self-organized tendon segments derived from rat tail tendon10. Moreover, Schiele et al. 2013, by using micromachined fibronectin-coated growth channels, directed the self-assembly of human dermal fibroblasts to form cellular fibers without the assistance of 3D scaffold, an approach that can capture key traits of embryonic tendon development11. In the study by Florida et al. 2016, bone marrow stromal cells were first expanded into bone and ligament lineages, next used to generate self-assembled monolayer cell sheets, which were then implemented to create a multiphasic bone-ligament-bone construct mimicking the native anterior cruciate ligament, a model aiming at improved understanding of ligament regeneration12. To elucidate tendon mechanotransduction processes, Mubyana et al. 2018 utilized a scaffold-free methodology by which single tendon fibers were created and subjected to mechanical loading protocol13. Organoids are self-organized 3D structures that mimic the native architecture, microenvironment, and functionality of tissues. 3D organoid cultures provide a more physiologically relevant model for studying tissue and organ biology as well as pathophysiology. Such models can also be used to induce tissue-specific differentiation of different stem/progenitor cell types14,15. Hence, implementing 3D organoid models in the field of T/L biology and tissue engineering becomes a very attractive approach9,16. Alternative cell sources can be implemented for the organoid assembly and stimulated toward tenogenic differentiation. One relevant cell type used for demonstration in this study is dermal fibroblasts7,17,18. These cells are easily accessible through a skin biopsy procedure, which is less invasive compared to bone marrow puncture or liposuction and can be multiplied fairly quickly to large numbers due to their good proliferative capacity. In contrast, more specialized cell types, such as T/L-resident fibroblasts, are more challenging to isolate and expand. Therefore, dermal fibroblasts were also used as a starting point for cell reprogramming technologies towards induced pluripotent embryonic stem cells19. Subjecting dermal fibroblasts to specific 3D culture conditions and signaling cues, such as transforming growth factor-beta 3 (TGF&#223;3), which has been reported to act as a key regulator of various cellular processes, including the formation and maintenance of T/L, can potentiate their in vitro tenogenic differentiation leading to the expression of tendon-specific genes and the deposition of T/L-typical ECM20,21.
Here, we describe and demonstrate a previously established and implemented 3-step (2D expansion, 2D stimulation, and 3D maturation) organoid protocol using commercially available normal adult human dermal fibroblasts (NHDFs) as a cell source, offering a valuable model for studying in vitro tenogenesis7. Despite the fact that this model is not equivalent to in vivo T/L tissue, it still provides a more physiologically relevant system that can be used for investigating cellular differentiation mechanisms, mimicking T/L pathophysiology in vitro, and establishing T/L personalized medicine and drug screening platforms. Moreover, in the future, studies can evaluate whether the 3D organoids are suitable for scaffold-free T/L engineering by further optimization as well as utilizable for the development of scaled-up mechanically robust constructs that closely resemble the dimensions and structural and biophysical properties of native T/L tissues.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير هندسة الأنسجة الأوتار مع نماذج 3D العضوية

عرض توضيحي لثقافة ورقة الخلايا المجمعة ذاتيا والتوليد اليدوي لوتر 3D / الأربطة الشبيهة بالعضوية باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية

We demonstrate a previous established and implement three-step organoid protocol using commercially available, normal human dermal fibroblasts as a cell source. The 3D organoid model holds several advantage for tissue engineering and regenerative medicine application. It mimics closely the cellular composition and organization as well as cell-to-cell and cell-to-matrix interactions of tendon tissues.The established 3D tendon-ligament organoid approach can be used as a model for tendon basic and applied research in the following areas. In vitro tenogenesis, disease mechanism, drug testing, and scaffold-free tendon tissue engineering.

تم إنشاء نموذج 3D T / L العضوي مسبقا وإثباته هنا من خلال تنفيذ NHDF المشتراة تجاريا (ن = 3 ، 3 عضويات لكل متبرع ، تم استخدام NHDF في الممرات 5-8). يتم تلخيص سير عمل النموذج في الشكل 1. يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية لتباين الطور لثقافة NHDF أثناء ما قبل التوسع في قوارير T-75 (<strong clas...

هنا ، نعرض نموذجا عضويا من ثلاث خطوات (توسع ثنائي الأبعاد [2D] ، تحفيز ثنائي الأبعاد ، نضج ثلاثي الأبعاد [3D]) يقدم أداة واعدة للبحث الأساسي في الأوتار وطريقة محتملة خالية من السقالات لهندسة أنسجة الأوتار.

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

لقد أظهرنا بروتوكولا عضويا سابقا تم إنشاؤه وتنفيذه من ثلاث خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية المتاحة تجاريا كمصدر للخلية. نموذج عضوي 3D يحمل العديد من المزايا لهندسة الأنسجة وتطبيق الطب التجديدي. إنه يحاكي عن كثب التركيب الخلوي والتنظيم بالإضافة إلى التفاعلات من خلية إلى خلية ومن خلية إلى مصفوفة لأنسجة الأوتار.يمكن استخدام نهج الأربطة العضوية 3D الراسخة كنموذج للبحوث الأساسية والتطبيقية في الأوتار في المجالات التالية. تكوين الأوتار في المختبر ، وآلية المرض ، واختبار الأدوية ، وهندسة أنسجة الأوتار الخالية من السقالات.

demonstration-self-assembled-cell-sheet-culture-manual-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

780 Views.  University of Würzburg. لقد أظهرنا بروتوكولا عضويا سابقا تم إنشاؤه وتنفيذه من ثلاث خطوات باستخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية المتاحة تجاريا كمصدر للخلية. نموذج عضوي 3D يحمل العديد من المزايا لهندسة الأنسجة وتطبيق الطب التجديدي. إنه يحاكي عن كثب التركيب الخلوي والتنظيم بالإضافة إلى...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير هندسة الأنسجة الأوتار مع نماذج 3D العضوية

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.