D.D. ve S.M.-D. BMBF Hibesi "CellWiTaL: İlaç araştırmaları için tekrarlanabilir hücre sistemleri - üç boyutlu hücresel yapılarda son derece spesifik tek hücrelerin transfer katmansız lazer baskısı" Teklif Nr. 13N15874'ü kabul edin. D.D. ve V.R.A., AB MSCA-COFUND Hibesini kabul etti: OSTASKILLS "Yeni nesil Osteoartrit araştırmalarının bütünsel eğitimi", GA Nr. 101034412. Tüm yazarlar teknik yardım için Bayan Beate Geyer'e teşekkür eder.

NOT: Tüm adımlar aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
1. NHDF'lerin kültürü ve ön genişlemesi
<ol><li>Yetişkin kriyoprezervasyonlu normal insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler, 1 x 106 hücreli) içeren kriyo-şişeyi 37 ° C'de neredeyse çözülene kadar hızla çözün.</li>
	<li>%1 penisilin / streptomisin (kalem / strep) (NHDF ortamı) ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış önceden ısıtılmış fibroblast büyüme ortamı 2 (bazal ortam,% 2 fetal buzağı serumu (FCS), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve insülin içeren kullanıma hazır kit) yavaşça hücrelere 37 ° C'de ısıtılır.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 12 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri bir T-75 şişesine aktarın ve çapraz şekilde kısa bir süre çalkalayın. T-75 şişesini 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı her 2 günde bir değiştirin. NHDF'leri% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar mikroskop altında gözlemleyin.</li>
</ol>2. 2D genişletme
<ol><li>İnkübatörün T-75 şişesini çıkarın ve NHDF ortamını çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücrelere 3 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de, hücreler şişeden ayrılana kadar (yaklaşık 3 dakika) inkübe edin.</li>
	<li>Tripsin etkisini nötralize etmek için 6 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>37 ° C'de önceden ısıtılmış% 10 fetal sığır serumu (FBS), 1x MEM amino asitleri,% 1 pen / strep ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) düşük glikozunda hücre peletini yeniden süspanse edin.</li>
	<li>NHDF'leri 10 cm'lik bir yapışkan hücre kültürü kabında 8 x 103 NHDFs/cm2 yoğunlukta (toplamda, 10 cm'lik tabak başına 4,4 x 105 NHDF) plakalayın. Çapraz bir şekilde nazikçe sallayın.</li>
	<li>10 cm'lik hücre kültürü kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin</li>
	<li>Hücreleri% 100 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 5 gün) mikroskop altında izleyin.</li>
</ol>3. 2D stimülasyon
<ol><li>NHDF'leri içeren 10 cm'lik hücre kültürü kaplarını (adım 2.6 ve 2.7'den itibaren) inkübatörden çıkarın. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.</li>
	<li>37 ° C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 50 μg/mL askorbik asit ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikozlu ortam ekleyin.</li>
	<li>Petri kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>NHDF'leri 14 gün boyunca mikroskop altında izleyin.</li>
</ol>4. 3D olgunlaşması
<ol><li>10 cm'lik hücre kültürü kabını inkübatörden çıkarın ve DMEM yüksek glikoz ortamını çıkarın.</li>
	<li>Oluşan hücre tabakasını bir hücre kazıyıcı ile tabaktan nazikçe ve hızlı bir şekilde ayırın. Ayırırken, hücre tabakasını aynı anda 3D çubuk benzeri bir organoid haline getirin.</li>
	<li>NHDF organoidlerini alın ve 10 cm'lik yapışmayan (hücreler için) bir Petri kabına yerleştirin. Bu çanak türü, organoidden plastiğe hücre göçünü önlemek için kullanılır.</li>
	<li>Bu zaman noktasında veya bir gün sonra (3D olgunlaşmanın 0. günü veya 1. günü), ıslak ağırlık, histolojik değerlendirme (daha kompakt hale geldikleri için 1. gün organoidleri tercih edilir), RNA ve protein izolasyonu gibi daha ileri analizler için bazı organoidleri toplayın.</li>
	<li>Organoidin kenarlarını metal pimlerle aşağıdaki gibi sabitleyin:<ol><li>Organoidin bir tarafını bir cımbızla dikkatlice tutun ve başka bir cımbızla yaklaşık% 10 eksenel uzamayı manuel olarak gerdirin. %10 eksenel uzamayı tahmin etmek için bir milimetre kağıt veya cetvel kullanın.</li>
		<li>Ardından, cımbızla bir metal pim alın ve sabitlemek için organoid kenardan plastik tabağa manuel olarak bastırın. Bu işlemi ikinci pim ile organoidin ikinci kenarına tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>37 °C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 1x MEM amino asit, 50 μg/mL askorbik asit, 10 ng/mL TGFß3 ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikoz ortamı ekleyin.</li>
	<li>10 cm'lik tabağı 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Organoidleri 14 gün boyunca düzenli olarak izleyin. NOT: Pimler gevşeyebilir, bu nedenle adım 4.5'te açıklanan tekniğin aynısını kullanarak yeniden sabitleyin.</li>
	<li>14 gün sonra, DMEM yüksek glikoz ortamını organoidlerden çıkarın. Organoidleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hassas bir terazi kullanarak 0. ve 14. günlerde ıslak ağırlık için organoidleri ölçün.<ol><li>Tartıya 10 cm'lik boş bir tabak yerleştirin ve yalnızca organoidlerin ağırlığının ölçüldüğünden emin olmak için ağırlığı sıfıra getirin. Kültür ortamını 10 cm'lik tabaktan tamamen çıkarın ve organoid ıslak ağırlığı tek tek ölçün. NOT: Bu çalışmada, 0. günde, donör başına üç organoid ve 14. günde, donör başına iki organoid tartıldı.</li>
	</ol></li>
	<li>Çalışma amaçlarına göre, NHDF organoidlerinin bir kısmını daha ileri histolojik analizlerde uygulayın veya sonraki DNA, RNA ve protein izolasyonu için steril DNA / RNA içermeyen tüpler kullanarak hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Histolojik inceleme için, her bir organoidi 5 mL önceden soğutulmuş (4 ° C)% 4 paraformaldehit içinde PBS'de (nötr pH'a ayarlanmış) buz üzerinde 45 dakika boyunca sabitleyin, ardından RT'de PBS yıkayın (her biri 2 x 5 dakika).</li>
	<li>Organoidleri histoloji için cam kavanozlara yerleştirerek bir sükroz gradyanı kullanarak sabit organoidleri kriyoprotekte edin. Organoidleri 4 ° C'de 2 saat boyunca PBS çözeltisinde% 10 sükroz içinde inkübe edin, ardından% 20 sükroz / PBS'yi 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin ve son olarak, 4 ° C'de% 30 sükroz / PBS gece boyunca inkübe edin. Sükroz çözeltilerini önce pipetleyerek ve ardından yeni çözelti ile doldurarak değiştirin.</li>
	<li>Organoidleri kriyo-ortama gömün.<ol><li>Bir strafor kutudaki kuru buzun üzerine bakır bir plaka yerleştirin ve 10 dakika soğutun.</li>
		<li>Ardından, bakır plakanın üzerine kriyo-ortam ile önceden doldurulmuş plastik bir kriyo kalıbı yerleştirin ve organoidi cımbız kullanarak kriyokalıbın altına hafifçe bastırın. Kriyomedium tamamen donana kadar bekleyin.</li>
		<li>Uzun organoidler için, önce bir neşter ile ikiye bölün ve iki yarıyı kriyokalıba birbirine paralel hale getirin. Histolojik analize tabi tutulması amaçlanan her organoid için prosedürü tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Numuneleri kriyoseksiyona kadar -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Bir kriyotom kullanarak, organoidleri 10 μm kalınlığında kesitler halinde uzunlamasına kesin ve standart protokol8'i kullanarak hematoksilen ve eozin (H & E) gibi histolojik boyamaya tabi tutun.</li>
</ol>

Tendon Araştırma ve Mühendisliği için Üç Adımlı Organoid Model

<ol>
	<li>Schneider, M., Angele, P., J&#228;rvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+plan+for+Achilles:+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing.">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li><li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+tendon+pathologies:+Triggers,+trails+and+end-state.">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).</li><li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy.">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li><li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments.">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li><li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendon+microenvironment:+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk.">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).</li><li>Docheva, D., M&#252;ller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologics+for+tendon+repair.">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li><li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model.">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).</li><li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model.">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li><li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+tendon+stem/progenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits.">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).</li><li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li><li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly.">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li><li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep.">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li><li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered,+scaffold-free+tendon+fibers.">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem/progenitor+cells+for+tendon+repair.">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).</li><li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+tendons:+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts.">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047 (2020).</li><li>Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+cell-based+therapies+for+tendon+repair.">Progress in cell-based therapies for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-&#946;+and+elongated+cell+shape.">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-&#946; and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li><li>Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., D&#252;nker, N., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+maintenance+of+tendon+progenitors+by+TGFbeta+signaling+are+essential+for+tendon+formation.">Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation.</a> Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).</li><li>Pattappa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physioxia+has+a+beneficial+effect+on+cartilage+matrix+production+in+interleukin-1+beta-inhibited+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis.">Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Cells. 8 (8), 936 (2019).</li><li>Shafiee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+physiologically+relevant+skin+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Small. 2304879, (2023).</li><li>Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+dish+makes+a+difference:+quantitative+comparison+of+polystyrene+culture+surfaces.">Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces.</a> Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).</li><li>Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+mechanics+of+thin+and+thick+composite+T-joints+reinforced+with+z-pins.">Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins.</a> Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).</li><li>Gelberman, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+ASCs+and+BMP-12+promotes+an+M2+macrophage+phenotype+and+enhances+tendon+healing.">Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing.</a> Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li></ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmada gösterilen sonuçlar, T / L dokularını incelemek için NHDF 3D organoid modelinin kurulması ve karakterizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar. 3 aşamalı protokol, T / L nişinin tipik özelliklerini sergileyen 3D çubuk benzeri organoidlerin oluşumuna yol açtı. Bu model daha önce Kroner-Weigl ve ark. 20237 ve burada çok ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
Şekil 2'de sunulan faz kontrast görünt?...

Tendonlar ve bağlar (T/L), vücuda temel destek ve stabilite sağlayan kas-iskelet sisteminin hayati bileşenleridir. Kritik rollerine rağmen, bu bağ dokuları dejenerasyona ve yaralanmaya eğilimlidir, bu da ağrıya ve hareketliliğin bozulmasına neden olur1. Ayrıca, sınırlı kan temini ve yavaş iyileşme kapasitesi kronik yaralanmalara yol açabilirken, yaşlanma, tekrarlayan hareketler ve yanlış rehabilitasyon gibi faktörler dejenerasyon ve yaralanma riskini daha da artırır2. Dinlenme, fizik tedavi ve cerrahi müdahaleler gibi geleneksel tedaviler, T / L yapısını ve işlevini tam olarak eski haline getiremez. Son birkaç yılda, araştırmacılar T / L bozuklukları için etkili tedaviler aramak için T / L'nin karmaşık doğasını daha iyi anlamaya çalıştılar 3,4,5. T / L, esas olarak tip I kollajen lifleri ve proteoglikanlardan oluşan, hiyerarşik olarak organize, hücre dışı matris (ECM) baskın bir yapı ile ayırt edilir, bu da in vitro6'da kopyalanması zor bir özelliktir. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü modelleri, T/L dokularının karakteristik üç boyutlu (3D) organizasyonunu yakalayamamakta, bu da translasyon potansiyellerini sınırlamakta ve T/L rejenerasyonu alanındaki yenilikçi ilerlemeyi engellemektedir.
Son zamanlarda, 3D organoid modellerin geliştirilmesi, çeşitli doku tiplerinin temel araştırmalarını ve iskelesiz doku mühendisliğini ilerletmek için yeni olanaklar sunmuştur7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, miyotendinöz bileşkeyi araştırmak için, Larkin ve ark. 2006, sıçan kuyruğu tendonu10'dan türetilen kendi kendini organize eden tendon segmentleri ile birlikte 3D iskelet kası yapıları geliştirdi. Ayrıca, Schiele ve ark. 2013, mikro işlenmiş fibronektin kaplı büyüme kanallarını kullanarak, embriyonik tendon gelişiminin temel özelliklerini yakalayabilen bir yaklaşım olan 3D iskele yardımı olmadan hücresel lifler oluşturmak için insan dermal fibroblastlarının kendi kendine montajını yönlendirdi11. Florida ve ark. 2016 tarafından yapılan çalışmada, kemik iliği stromal hücreleri önce kemik ve bağ soylarına genişletildi, daha sonra kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı hücre tabakaları oluşturmak için kullanıldı, bunlar daha sonra doğal ön çapraz bağı taklit eden çok fazlı bir kemik-bağ-kemik yapısı oluşturmak için uygulandı, bağ rejenerasyonunun daha iyi anlaşılmasını amaçlayan bir model12. Tendon mekanotransdüksiyon süreçlerini aydınlatmak için Mubyana ve ark. 2018, tek tendon liflerinin oluşturulduğu ve mekanik yükleme protokolüne tabi tutulduğu iskelesiz bir metodoloji kullandı13. Organoidler, dokuların doğal mimarisini, mikro çevresini ve işlevselliğini taklit eden, kendi kendini organize eden 3B yapılardır. 3D organoid kültürler, doku ve organ biyolojisinin yanı sıra patofizyolojiyi incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir model sağlar. Bu tür modeller, farklı kök/progenitör hücre tiplerinindokuya özgü farklılaşmasını indüklemek için de kullanılabilir 14,15. Bu nedenle, T/L biyolojisi ve doku mühendisliği alanında 3D organoid modellerin uygulanması çok çekici bir yaklaşım haline gelmektedir 9,16. Organoid montajı için alternatif hücre kaynakları uygulanabilir ve tenojenik farklılaşmaya doğru uyarılabilir. Bu çalışmada gösterim için kullanılan ilgili bir hücre tipi dermal fibroblastlar 7,17,18'dir. Bu hücrelere, kemik iliği ponksiyonu veya liposuction ile karşılaştırıldığında daha az invaziv olan ve iyi proliferatif kapasiteleri nedeniyle oldukça hızlı bir şekilde büyük sayılara çarpılabilen bir cilt biyopsisi prosedürü ile kolayca erişilebilir. Buna karşılık, T / L'de yerleşik fibroblastlar gibi daha özel hücre tiplerinin izole edilmesi ve genişletilmesi daha zordur. Bu nedenle, dermal fibroblastlar, indüklenmiş pluripotent embriyonik kök hücrelere yönelik hücre yeniden programlama teknolojileri için bir başlangıç noktası olarak da kullanılmıştır19. Dermal fibroblastların, T/L'nin oluşumu ve sürdürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerin anahtar bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği bildirilen transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGFß3) gibi spesifik 3D kültür koşullarına ve sinyal ipuçlarına tabi tutulması, tendona özgü genlerin ekspresyonuna ve T/L-tipik ECM20'nin birikmesine yol açan in vitro tenojenik farklılaşmalarını güçlendirebilir, 21.
Burada, hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal yetişkin insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler) kullanarak önceden kurulmuş ve uygulanmış 3 aşamalı (2D genişleme, 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma) organoid protokolünü tanımlıyor ve gösteriyoruz ve in vitro tenogenez7. Bu model in vivo T/L dokusuna eşdeğer olmamasına rağmen, hücresel farklılaşma mekanizmalarını araştırmak, in vitro T/L patofizyolojisini taklit etmek ve T/L kişiselleştirilmiş tıp ve ilaç tarama platformları oluşturmak için kullanılabilecek fizyolojik olarak daha ilgili bir sistem sunmaktadır. Ayrıca, gelecekte, çalışmalar, 3D organoidlerin iskelesiz T/L mühendisliği için uygun olup olmadığını, daha fazla optimizasyon ile değerlendirebilir ve aynı zamanda doğal T/L dokularının boyutlarına ve yapısal ve biyofiziksel özelliklerine çok benzeyen ölçeklendirilmiş mekanik olarak sağlam yapıların geliştirilmesi için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;&#160;</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm adherent cell culture dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm non-adherent petri dish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-medium</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands&#160;&#160;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold standard&#160;</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose&#160;</td>
			<td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose medium&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>DMEM-HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>DMEM-LPXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>&#160;Anprotec, Bruckberg, Germany&#160;</td>
			<td>AC-SM-0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>C-23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope with high resolution camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Zeiss Axio Observer with&#160; Axiocam 506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>NEAA-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal pins&#160;</td>
			<td>EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic&#160;</td>
			<td>04.31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td>&#160;PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td>C-12302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>&#160;AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;3&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems, Wiesbaden, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;8420-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% DPBS&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;TRY-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of self-assembled cell sheet culture and manual generation of a 3d tendon/ligament-like organoid by using human dermal fibroblasts

Tendonlar ve bağlar (T/L), kas-iskelet sistemini birleştiren güçlü hiyerarşik olarak organize edilmiş yapılardır. Bu dokular, sıkı bir şekilde düzenlenmiş kollajen tip I açısından zengin hücre dışı matrise (ECM) ve esas olarak paralel sıralar halinde konumlandırılmış T / L soy hücrelerine sahiptir. Yaralanmadan sonra, T/L, yüksek başarısızlık riski ve genellikle tatmin edici olmayan onarım sonuçları ile rehabilitasyon için uzun bir süre gerektirir. T / L biyoloji araştırmalarındaki son gelişmelere rağmen, kalan zorluklardan biri, T / L alanının, T / L oluşum sürecini in vitro olarak özetleyebilen standart bir farklılaşma protokolünden yoksun olmasıdır. Örneğin, mezenkimal öncü hücrelerin kemik ve yağ farklılaşması, sadece standart iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve spesifik stimülasyon ortamının eklenmesini gerektirir. Kıkırdak farklılaşması için üç boyutlu (3D) pelet kültürü ve TGFß takviyesi gereklidir. Bununla birlikte, tendona hücre farklılaşması, ideal olarak dinamik mekanik stimülasyona da tabi olması gereken çok düzenli bir 3D kültür modeline ihtiyaç duyar. Kendi ECM, otokrin ve parakrin faktörlerine sahip doğal bir mikro ortam sağlayan, kendi kendine monte edilmiş bir hücre tabakasından 3D çubuk benzeri bir yapı oluşturmak için 3 adımlı (genişleme, stimülasyon ve olgunlaşma) bir organoid model oluşturduk. Bu çubuk benzeri organoidler, zengin ECM içinde çok katmanlı bir hücresel mimariye sahiptir ve statik mekanik gerilmeye maruz kalmak için oldukça kolay bir şekilde ele alınabilir. Burada, piyasada bulunan dermal fibroblastları kullanarak 3 aşamalı protokolü gösterdik. Bu hücre tipinin sağlam ve ECM açısından bol organoidler oluşturduğunu gösterebiliriz. Tarif edilen prosedür, kültür ortamı açısından daha da optimize edilebilir ve dinamik eksenel mekanik stimülasyona doğru optimize edilebilir. Aynı şekilde, alternatif hücre kaynakları, T/L organoidleri oluşturma potansiyelleri açısından test edilebilir ve böylece T/L farklılaşmasına uğrayabilir. Özetle, yerleşik 3D T / L organoid yaklaşımı, tendon temel araştırması ve hatta iskele içermeyen T / L mühendisliği için bir model olarak kullanılabilir.

Tendons and ligaments (T/L) are vital components of the musculoskeletal system that provide essential support and stability to the body. Despite their critical role, these connective tissues are prone to degeneration and injury, causing pain and impairment of mobility1. Moreover, their limited blood supply and slow healing capacity can lead to chronic injuries, whereas factors such as aging, repetitive motion, and improper rehabilitation further increase the risk of degeneration and injury2. Conventional treatments, such as rest, physical therapy, and surgical interventions, are unable to fully restore the T/L structure and function. Over the past few years, researchers have strived to better understand the intricate nature of T/L in order to seek effective treatments for T/L disorders3,4,5. T/L are distinguished by a hierarchically organized, extracellular matrix (ECM)-dominated structure, composed primarily of type I collagen fibers and proteoglycans, a feature that is difficult to be replicated in vitro6. Traditional two-dimensional (2D) cell culture models fail to capture the characteristic three-dimensional (3D) organization of T/L tissues, limiting their translational potential as well as hindering the innovative progress in the field of T/L regeneration.
Recently, the development of 3D organoid models has offered new possibilities for advancing basic research and scaffolds-free tissue engineering of various tissue types7,8,9,10,11,12,13. For example, to investigate myotendinous junction, Larkin et al. 2006 developed 3D skeletal muscle constructs together with self-organized tendon segments derived from rat tail tendon10. Moreover, Schiele et al. 2013, by using micromachined fibronectin-coated growth channels, directed the self-assembly of human dermal fibroblasts to form cellular fibers without the assistance of 3D scaffold, an approach that can capture key traits of embryonic tendon development11. In the study by Florida et al. 2016, bone marrow stromal cells were first expanded into bone and ligament lineages, next used to generate self-assembled monolayer cell sheets, which were then implemented to create a multiphasic bone-ligament-bone construct mimicking the native anterior cruciate ligament, a model aiming at improved understanding of ligament regeneration12. To elucidate tendon mechanotransduction processes, Mubyana et al. 2018 utilized a scaffold-free methodology by which single tendon fibers were created and subjected to mechanical loading protocol13. Organoids are self-organized 3D structures that mimic the native architecture, microenvironment, and functionality of tissues. 3D organoid cultures provide a more physiologically relevant model for studying tissue and organ biology as well as pathophysiology. Such models can also be used to induce tissue-specific differentiation of different stem/progenitor cell types14,15. Hence, implementing 3D organoid models in the field of T/L biology and tissue engineering becomes a very attractive approach9,16. Alternative cell sources can be implemented for the organoid assembly and stimulated toward tenogenic differentiation. One relevant cell type used for demonstration in this study is dermal fibroblasts7,17,18. These cells are easily accessible through a skin biopsy procedure, which is less invasive compared to bone marrow puncture or liposuction and can be multiplied fairly quickly to large numbers due to their good proliferative capacity. In contrast, more specialized cell types, such as T/L-resident fibroblasts, are more challenging to isolate and expand. Therefore, dermal fibroblasts were also used as a starting point for cell reprogramming technologies towards induced pluripotent embryonic stem cells19. Subjecting dermal fibroblasts to specific 3D culture conditions and signaling cues, such as transforming growth factor-beta 3 (TGF&#223;3), which has been reported to act as a key regulator of various cellular processes, including the formation and maintenance of T/L, can potentiate their in vitro tenogenic differentiation leading to the expression of tendon-specific genes and the deposition of T/L-typical ECM20,21.
Here, we describe and demonstrate a previously established and implemented 3-step (2D expansion, 2D stimulation, and 3D maturation) organoid protocol using commercially available normal adult human dermal fibroblasts (NHDFs) as a cell source, offering a valuable model for studying in vitro tenogenesis7. Despite the fact that this model is not equivalent to in vivo T/L tissue, it still provides a more physiologically relevant system that can be used for investigating cellular differentiation mechanisms, mimicking T/L pathophysiology in vitro, and establishing T/L personalized medicine and drug screening platforms. Moreover, in the future, studies can evaluate whether the 3D organoids are suitable for scaffold-free T/L engineering by further optimization as well as utilizable for the development of scaled-up mechanically robust constructs that closely resemble the dimensions and structural and biophysical properties of native T/L tissues.

Yazar Spotlight: 3D Organoid Modellerle Tendon Doku Mühendisliğini İlerletmek

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

We demonstrate a previous established and implement three-step organoid protocol using commercially available, normal human dermal fibroblasts as a cell source. The 3D organoid model holds several advantage for tissue engineering and regenerative medicine application. It mimics closely the cellular composition and organization as well as cell-to-cell and cell-to-matrix interactions of tendon tissues.The established 3D tendon-ligament organoid approach can be used as a model for tendon basic and applied research in the following areas. In vitro tenogenesis, disease mechanism, drug testing, and scaffold-free tendon tissue engineering.

3D T/L organoid modeli daha önce burada ticari olarak satın alınan NHDF uygulanarak kurulmuş ve gösterilmiştir (n=3, donör başına 3 organoid, NHDF 5-8 pasajlarında kullanılmıştır). Model iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Şekil 2 , T-75 şişelerinde ön genişleme sırasında (Şekil 2A) ve ayrıca 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında 2D genişletme adımında kültürün başlangıcında ve 5 günlük kül...

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

Hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal insan dermal fibroblastlarını kullanarak daha önce kurulmuş ve üç aşamalı organoid protokolünü uyguluyoruz. 3D organoid model, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulaması için çeşitli avantajlara sahiptir. Tendon dokularının hücresel bileşimi ve organizasyonunun yanı sıra hücreden hücreye ve hücreden matrise etkileşimlerini yakından taklit eder.Kurulan 3D tendon-ligament organoid yaklaşımı, aşağıdaki alanlarda tendon temel ve uygulamalı araştırmalar için bir model olarak kullanılabilir. İn vitro tenogenez, hastalık mekanizması, ilaç testi ve iskelesiz tendon dokusu mühendisliği.

demonstration-self-assembled-cell-sheet-culture-manual-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

744 Görüntüleme.  University of Würzburg. Hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal insan dermal fibroblastlarını kullanarak daha önce kurulmuş ve üç aşamalı organoid protokolünü uyguluyoruz. 3D organoid model, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulaması için çeşitli avantajlara sahiptir. Tendon dokularının hücresel bileşimi ve organizasyonunun yanı sıra hücreden hücreye ve hücreden matrise etkileşimlerini yakından taklit eder.Kurulan 3D tendon-ligament organoid yaklaşımı,...

Video: Yazar Spotlight: 3D Organoid Modellerle Tendon Doku Mühendisliğini İlerletmek

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.