D.D. e S.M.-D. riconoscere la sovvenzione BMBF "CellWiTaL: sistemi cellulari riproducibili per la ricerca farmacologica - stampa laser senza strato di trasferimento di singole cellule altamente specifiche in strutture cellulari tridimensionali" Proposta n. 13N15874. D.D. e V.R.A. riconoscono la sovvenzione EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Formazione olistica delle ricerche sull'osteoartrite di nuova generazione" GA Nr. 101034412. Tutti gli autori ringraziano la signora Beate Geyer per l'assistenza tecnica.

NOTA: Tutte le fasi devono essere eseguite utilizzando tecniche asettiche.
1. Coltura e pre-espansione dei NHDF
<ol><li>Scongelare rapidamente la crio-fiala contenente fibroblasti dermici umani normali adulti crioconservati (NHDF, 1 x 106 cellule) a 37 °C fino a quando non si scongelano quasi.</li>
	<li>Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di crescita dei fibroblasti preriscaldato 2 (kit pronto all'uso che include terreno basale, siero fetale di vitello al 2% (FCS), fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) e insulina) integrato con penicillina/streptomicina all'1% (penna/streptococco) (terreno NHDF), preriscaldato a 37 °C alle cellule.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 12 mL di terreno NHDF preriscaldato.</li>
	<li>Trasferire le cellule in un matraccio T-75 e agitare brevemente in senso trasversale. Collocare il matraccio T-75 a 37 °C in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 .</li>
	<li>Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Osservare gli NHDF al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 70% - 80%.</li>
</ol>2. Espansione 2D
<ol><li>Estrarre il pallone T-75 dell'incubatrice e rimuovere il mezzo NHDF. Lavare le cellule con soluzione salina tampone fosfato preriscaldata (PBS).</li>
	<li>Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% alle cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 fino a quando le cellule non si staccano dal matraccio (circa 3 minuti).</li>
	<li>Aggiungere 6 ml di terreno NHDF preriscaldato per neutralizzare l'azione della tripsina. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1x aminoacidi MEM, 1% penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.</li>
	<li>Piastra gli NHDF in una piastra di coltura cellulare aderente da 10 cm a una densità di 8 x 103 NHDF/cm2 (in totale, 4,4 x 105 NHDF per piastra da 10 cm). Oscilla delicatamente in modo trasversale.</li>
	<li>Posizionare la piastra di coltura cellulare da 10 cm a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni</li>
	<li>Monitorare le cellule al microscopio fino a raggiungere la confluenza del 100% (ca. 5 giorni).</li>
</ol>3. Stimolazione 2D
<ol><li>Estrarre dall'incubatore le piastre per colture cellulari da 10 cm contenenti gli NHDF (dai passaggi 2.6 e 2.7). Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS preriscaldato.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 50 μg/mL di acido ascorbico e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.</li>
	<li>Porre la capsula di Petri a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.</li>
	<li>Monitorare gli NHDF al microscopio per 14 giorni.</li>
</ol>4. 3D maturazione
<ol><li>Estrarre la piastra di coltura cellulare da 10 cm dall'incubatore e rimuovere il terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM.</li>
	<li>Staccare delicatamente e rapidamente il foglio cellulare formato dal piatto con un raschietto cellulare. Durante il distacco, arrotolare contemporaneamente il foglio cellulare in un organoide 3D simile a un bastoncino.</li>
	<li>Prelevare e posizionare gli organoidi NHDF in una piastra di Petri non aderente (per cellule) di 10 cm. Questo tipo di piatto viene utilizzato per evitare l'emigrazione cellulare dall'organoide alla plastica.</li>
	<li>A questo punto o un giorno dopo (giorno 0 o giorno 1 di maturazione 3D), raccogliere alcuni degli organoidi per ulteriori analisi come il peso umido, la valutazione istologica (gli organoidi del giorno 1 sono preferibili in quanto diventano più compatti), l'isolamento dell'RNA e delle proteine.</li>
	<li>Fissare i bordi dell'organoide con perni metallici come segue:<ol><li>Tenere con cura un lato dell'organoide con una pinzetta e con un'altra pinzetta applicare delicatamente uno stiramento manuale di circa il 10% di allungamento assiale. Per stimare l'allungamento assiale del 10%, utilizzare carta millimetrata o righello.</li>
		<li>Quindi, prendi uno spillo di metallo con la pinzetta e premi manualmente attraverso il bordo dell'organoide nel piatto di plastica per fissarlo. Ripetere questa procedura con il secondo perno sul secondo bordo dell'organoide.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 10 ml di terreno ad alto contenuto di glucosio DMEM integrato con il 10% di FBS, 1x aminoacidi MEM, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 ng/mL di TGFß3 e l'1% di penna/streptococco, preriscaldato a 37 °C.</li>
	<li>Posizionare la pirofila da 10 cm a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambia il mezzo ogni 2 giorni.</li>
	<li>Monitorare regolarmente gli organoidi per 14 giorni. NOTA: i perni potrebbero allentarsi, quindi rifissarli utilizzando la stessa tecnica descritta nel passaggio 4.5.</li>
	<li>Dopo 14 giorni, rimuovere il mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM dagli organoidi. Lavare gli organoidi con PBS preriscaldato.</li>
	<li>Misurare gli organoidi per il peso umido al giorno 0 e al giorno 14 utilizzando una bilancia di precisione.<ol><li>Posizionare un piatto vuoto di 10 cm sulla bilancia e tarare il peso a zero per assicurarsi che venga misurato solo il peso degli organoidi. Rimuovere completamente il terreno di coltura dal piatto da 10 cm e misurare il peso umido dell'organoide uno per uno. NOTA: In questo studio, al giorno 0, sono stati pesati tre organoidi per donatore e al giorno 14 due organoidi per donatore.</li>
	</ol></li>
	<li>Secondo gli scopi dello studio, implementare alcuni degli organoidi NHDF in ulteriori analisi istologiche o congelarli immediatamente in azoto liquido utilizzando provette sterili prive di DNA/RNA per il successivo isolamento di DNA, RNA e proteine e quindi conservarle a -80 °C.</li>
	<li>Per l'indagine istologica, fissare ciascun organoide in 5 mL di paraformaldeide al 4% preraffreddata (4 °C) in PBS (regolata a pH neutro) per 45 minuti su ghiaccio, seguita da un lavaggio PBS a RT (2 x 5 min ciascuno).</li>
	<li>Crioproteggere gli organoidi fissati utilizzando un gradiente di saccarosio mettendo gli organoidi in barattoli di vetro per l'istologia. Incubare gli organoidi in saccarosio al 10% in soluzione di PBS per 2 ore a 4 °C, successivamente saccarosio al 20%/PBS per 2 ore a 4 °C e infine incubazione notturna al 30% di saccarosio/PBS a 4 °C. Modificare le soluzioni di saccarosio prima pipettando e poi riempiendo con la nuova soluzione.</li>
	<li>Incorporare gli organoidi nel crio-mezzo.<ol><li>Metti una piastra di rame sul ghiaccio secco in una scatola di polistirolo e lascia raffreddare per 10 minuti.</li>
		<li>Quindi, posizionare un criostampo di plastica, preriempito con crio-mezzo, sulla piastra di rame e premere delicatamente l'organoide sul fondo del criomedio usando una pinzetta. Attendere che il criomezzo sia completamente congelato.</li>
		<li>Per gli organoidi lunghi, prima tagliare a metà con un bisturi e mettere le due metà parallele tra loro nel criostampo. Ripetere la procedura per ciascun organoide destinato ad essere sottoposto ad analisi istologica.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservare i campioni a -20 °C fino alla criosezione.</li>
	<li>Utilizzando un criotomo, tagliare longitudinalmente gli organoidi in sezioni spesse 10 μm e sottoporli a colorazione istologica come ematossilina ed eosina (H&E) utilizzando il protocollo standard8.</li>
</ol>

Modello di organoide in tre fasi per la ricerca e l'ingegneria tendinea

<ol>
	<li>Schneider, M., Angele, P., J&#228;rvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+plan+for+Achilles:+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing.">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li><li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+tendon+pathologies:+Triggers,+trails+and+end-state.">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).</li><li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy.">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li><li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments.">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li><li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendon+microenvironment:+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk.">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).</li><li>Docheva, D., M&#252;ller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologics+for+tendon+repair.">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li><li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model.">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).</li><li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model.">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li><li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+tendon+stem/progenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits.">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).</li><li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li><li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly.">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li><li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep.">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li><li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered,+scaffold-free+tendon+fibers.">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem/progenitor+cells+for+tendon+repair.">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).</li><li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+tendons:+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts.">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047 (2020).</li><li>Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+cell-based+therapies+for+tendon+repair.">Progress in cell-based therapies for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-&#946;+and+elongated+cell+shape.">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-&#946; and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li><li>Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., D&#252;nker, N., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+maintenance+of+tendon+progenitors+by+TGFbeta+signaling+are+essential+for+tendon+formation.">Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation.</a> Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).</li><li>Pattappa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physioxia+has+a+beneficial+effect+on+cartilage+matrix+production+in+interleukin-1+beta-inhibited+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis.">Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Cells. 8 (8), 936 (2019).</li><li>Shafiee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+physiologically+relevant+skin+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Small. 2304879, (2023).</li><li>Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+dish+makes+a+difference:+quantitative+comparison+of+polystyrene+culture+surfaces.">Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces.</a> Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).</li><li>Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+mechanics+of+thin+and+thick+composite+T-joints+reinforced+with+z-pins.">Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins.</a> Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).</li><li>Gelberman, R. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

I risultati dimostrati in questo studio forniscono preziose informazioni sulla creazione e la caratterizzazione del modello di organoide 3D NHDF per lo studio dei tessuti T/L. Il protocollo in 3 fasi ha portato alla formazione di organoidi 3D simili a bastoncelli che presentano caratteristiche tipiche della nicchia T/L. Questo modello è stato precedentemente riportato in Kroner-Weigl et al. 20237 e dimostrato in modo molto dettagliato qui.
Le immagini a contra...

Tendini e legamenti (T/L) sono componenti vitali del sistema muscolo-scheletrico che forniscono supporto e stabilità essenziali al corpo. Nonostante il loro ruolo critico, questi tessuti connettivi sono soggetti a degenerazione e lesioni, causando dolore e compromissione della mobilità1. Inoltre, il loro limitato apporto di sangue e la lenta capacità di guarigione possono portare a lesioni croniche, mentre fattori come l'invecchiamento, il movimento ripetitivo e la riabilitazione impropria aumentano ulteriormente il rischio di degenerazione e lesioni2. I trattamenti convenzionali, come il riposo, la terapia fisica e gli interventi chirurgici, non sono in grado di ripristinare completamente la struttura e la funzione T/L. Negli ultimi anni, i ricercatori si sono sforzati di comprendere meglio la natura intricata del T/L al fine di cercare trattamenti efficaci per i disturbi T/L 3,4,5. I T/L si distinguono per una struttura gerarchicamente organizzata, dominata dalla matrice extracellulare (ECM), composta principalmente da fibre di collagene di tipo I e proteoglicani, una caratteristica difficile da replicare in vitro6. I tradizionali modelli di coltura cellulare bidimensionale (2D) non riescono a catturare la caratteristica organizzazione tridimensionale (3D) dei tessuti T/L, limitando il loro potenziale traduzionale e ostacolando il progresso innovativo nel campo della rigenerazione T/L.
Recentemente, lo sviluppo di modelli 3D di organoidi ha offerto nuove possibilità per far progredire la ricerca di base e l'ingegneria tissutale senza scaffold di vari tipi di tessuto 7,8,9,10,11,12,13. Ad esempio, per studiare la giunzione miotendinea, Larkin et al. 2006 hanno sviluppato costrutti muscolari scheletrici 3D insieme a segmenti tendinei auto-organizzati derivati dal tendine della coda di ratto10. Inoltre, Schiele et al. 2013, utilizzando canali di crescita rivestiti di fibronectina microlavorati, ha diretto l'autoassemblaggio dei fibroblasti dermici umani per formare fibre cellulari senza l'assistenza di scaffold 3D, un approccio che può catturare i tratti chiave dello sviluppo del tendine embrionale11. Nello studio di Florida et al. 2016, le cellule stromali del midollo osseo sono state prima espanse in linee ossee e legamentose, successivamente utilizzate per generare fogli cellulari monostrato autoassemblati, che sono stati poi implementati per creare un costrutto osseo-legamento-osso multifasico che imita il legamento crociato anteriore nativo, un modello che mira a migliorare la comprensione della rigenerazione dei legamenti12. Per chiarire i processi di meccanotrasduzione tendinea, Mubyana et al. 2018 hanno utilizzato una metodologia senza scaffold mediante la quale sono state create singole fibre tendinee e sottoposte al protocollo di carico meccanico13. Gli organoidi sono strutture 3D auto-organizzate che imitano l'architettura nativa, il microambiente e la funzionalità dei tessuti. Le colture di organoidi 3D forniscono un modello fisiologicamente più rilevante per lo studio della biologia dei tessuti e degli organi, nonché della fisiopatologia. Tali modelli possono anche essere utilizzati per indurre la differenziazione tessuto-specifica di diversi tipi di cellule staminali/progenitrici14,15. Pertanto, l'implementazione di modelli 3D di organoidi nel campo della biologia T/L e dell'ingegneria tissutale diventa un approccio molto interessante 9,16. Fonti cellulari alternative possono essere implementate per l'assemblaggio degli organoidi e stimolate verso la differenziazione tenogenica. Un tipo di cellula rilevante utilizzato per la dimostrazione in questo studio sono i fibroblasti dermici 7,17,18. Queste cellule sono facilmente accessibili attraverso una procedura di biopsia cutanea, che è meno invasiva rispetto alla puntura del midollo osseo o alla liposuzione e può essere moltiplicata abbastanza rapidamente in grandi numeri grazie alla loro buona capacità proliferativa. Al contrario, i tipi di cellule più specializzati, come i fibroblasti residenti in T/L, sono più difficili da isolare ed espandere. Pertanto, i fibroblasti dermici sono stati utilizzati anche come punto di partenza per le tecnologie di riprogrammazione cellulare verso cellule staminali embrionali pluripotenti indotte19. Sottoporre i fibroblasti dermici a specifiche condizioni di coltura 3D e segnali di segnalazione, come il fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGFß3), che è stato riportato agire come regolatore chiave di vari processi cellulari, tra cui la formazione e il mantenimento di T/L, può potenziare la loro differenziazione tenogenica in vitro portando all'espressione di geni tendinei specifici e alla deposizione di ECM20 T/L-tipica, 21.
Qui, descriviamo e dimostriamo un protocollo di organoidi in 3 fasi (espansione 2D, stimolazione 2D e maturazione 3D) precedentemente stabilito e implementato utilizzando fibroblasti dermici umani adulti normali (NHDF) disponibili in commercio come fonte cellulare, offrendo un modello prezioso per lo studio della tenogenesi in vitro 7. Nonostante il fatto che questo modello non sia equivalente al tessuto T/L in vivo, fornisce comunque un sistema fisiologicamente più rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi di differenziazione cellulare, imitare la fisiopatologia T/L in vitro e stabilire piattaforme di medicina personalizzata T/L e screening farmacologico. Inoltre, in futuro, gli studi potranno valutare se gli organoidi 3D sono adatti per l'ingegneria T/L senza scaffold mediante un'ulteriore ottimizzazione e utilizzabili per lo sviluppo di costrutti meccanicamente robusti su larga scala che assomigliano molto alle dimensioni e alle proprietà strutturali e biofisiche dei tessuti T/L nativi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;&#160;</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm adherent cell culture dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm non-adherent petri dish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-medium</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands&#160;&#160;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold standard&#160;</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose&#160;</td>
			<td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose medium&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>DMEM-HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>DMEM-LPXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>&#160;Anprotec, Bruckberg, Germany&#160;</td>
			<td>AC-SM-0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>C-23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope with high resolution camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Zeiss Axio Observer with&#160; Axiocam 506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>NEAA-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal pins&#160;</td>
			<td>EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic&#160;</td>
			<td>04.31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td>&#160;PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td>C-12302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>&#160;AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;3&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems, Wiesbaden, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;8420-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% DPBS&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;TRY-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of self-assembled cell sheet culture and manual generation of a 3d tendon/ligament-like organoid by using human dermal fibroblasts

Tendini e legamenti (T/L) sono strutture forti organizzate gerarchicamente che uniscono il sistema muscolo-scheletrico. Questi tessuti hanno una matrice extracellulare ricca di collagene (ECM) di tipo I e cellule del lignaggio T/L posizionate principalmente in file parallele. Dopo l'infortunio, T/L richiede molto tempo per la riabilitazione con un alto rischio di fallimento e risultati di riparazione spesso insoddisfacenti. Nonostante i recenti progressi nella ricerca biologica sul T/L, una delle sfide rimanenti è che il campo T/L manca ancora di un protocollo di differenziazione standardizzato in grado di ricapitolare il processo di formazione del T/L in vitro. Ad esempio, la differenziazione ossea e grassa delle cellule precursori mesenchimali richiede solo una coltura cellulare bidimensionale (2D) standard e l'aggiunta di specifici mezzi di stimolazione. Per la differenziazione in cartilagine, è necessaria la coltura tridimensionale (3D) in pellet e l'integrazione di TGFß. Tuttavia, la differenziazione cellulare al tendine necessita di un modello di coltura 3D molto ordinato, che idealmente dovrebbe essere anche soggetto a stimolazione meccanica dinamica. Abbiamo stabilito un modello di organoide in 3 fasi (espansione, stimolazione e maturazione) per formare una struttura 3D simile a un bastoncino da un foglio cellulare autoassemblato, che fornisce un microambiente naturale con i propri fattori ECM, autocrini e paracrini. Questi organoidi a bastoncino hanno un'architettura cellulare multistrato all'interno di una ricca ECM e possono essere maneggiati abbastanza facilmente per l'esposizione a sollecitazioni meccaniche statiche. Qui, abbiamo dimostrato il protocollo in 3 fasi utilizzando fibroblasti dermici disponibili in commercio. Abbiamo potuto dimostrare che questo tipo di cellula forma organoidi robusti e abbondanti nella ECM. La procedura descritta può essere ulteriormente ottimizzata in termini di terreni di coltura e ottimizzata verso la stimolazione meccanica assiale dinamica. Allo stesso modo, le fonti cellulari alternative possono essere testate per il loro potenziale di formare organoidi T/L e quindi subire la differenziazione T/L. In sintesi, l'approccio consolidato degli organoidi T/L 3D può essere utilizzato come modello per la ricerca di base sui tendini e persino per l'ingegneria T/L senza scaffold.

Tendons and ligaments (T/L) are vital components of the musculoskeletal system that provide essential support and stability to the body. Despite their critical role, these connective tissues are prone to degeneration and injury, causing pain and impairment of mobility1. Moreover, their limited blood supply and slow healing capacity can lead to chronic injuries, whereas factors such as aging, repetitive motion, and improper rehabilitation further increase the risk of degeneration and injury2. Conventional treatments, such as rest, physical therapy, and surgical interventions, are unable to fully restore the T/L structure and function. Over the past few years, researchers have strived to better understand the intricate nature of T/L in order to seek effective treatments for T/L disorders3,4,5. T/L are distinguished by a hierarchically organized, extracellular matrix (ECM)-dominated structure, composed primarily of type I collagen fibers and proteoglycans, a feature that is difficult to be replicated in vitro6. Traditional two-dimensional (2D) cell culture models fail to capture the characteristic three-dimensional (3D) organization of T/L tissues, limiting their translational potential as well as hindering the innovative progress in the field of T/L regeneration.
Recently, the development of 3D organoid models has offered new possibilities for advancing basic research and scaffolds-free tissue engineering of various tissue types7,8,9,10,11,12,13. For example, to investigate myotendinous junction, Larkin et al. 2006 developed 3D skeletal muscle constructs together with self-organized tendon segments derived from rat tail tendon10. Moreover, Schiele et al. 2013, by using micromachined fibronectin-coated growth channels, directed the self-assembly of human dermal fibroblasts to form cellular fibers without the assistance of 3D scaffold, an approach that can capture key traits of embryonic tendon development11. In the study by Florida et al. 2016, bone marrow stromal cells were first expanded into bone and ligament lineages, next used to generate self-assembled monolayer cell sheets, which were then implemented to create a multiphasic bone-ligament-bone construct mimicking the native anterior cruciate ligament, a model aiming at improved understanding of ligament regeneration12. To elucidate tendon mechanotransduction processes, Mubyana et al. 2018 utilized a scaffold-free methodology by which single tendon fibers were created and subjected to mechanical loading protocol13. Organoids are self-organized 3D structures that mimic the native architecture, microenvironment, and functionality of tissues. 3D organoid cultures provide a more physiologically relevant model for studying tissue and organ biology as well as pathophysiology. Such models can also be used to induce tissue-specific differentiation of different stem/progenitor cell types14,15. Hence, implementing 3D organoid models in the field of T/L biology and tissue engineering becomes a very attractive approach9,16. Alternative cell sources can be implemented for the organoid assembly and stimulated toward tenogenic differentiation. One relevant cell type used for demonstration in this study is dermal fibroblasts7,17,18. These cells are easily accessible through a skin biopsy procedure, which is less invasive compared to bone marrow puncture or liposuction and can be multiplied fairly quickly to large numbers due to their good proliferative capacity. In contrast, more specialized cell types, such as T/L-resident fibroblasts, are more challenging to isolate and expand. Therefore, dermal fibroblasts were also used as a starting point for cell reprogramming technologies towards induced pluripotent embryonic stem cells19. Subjecting dermal fibroblasts to specific 3D culture conditions and signaling cues, such as transforming growth factor-beta 3 (TGF&#223;3), which has been reported to act as a key regulator of various cellular processes, including the formation and maintenance of T/L, can potentiate their in vitro tenogenic differentiation leading to the expression of tendon-specific genes and the deposition of T/L-typical ECM20,21.
Here, we describe and demonstrate a previously established and implemented 3-step (2D expansion, 2D stimulation, and 3D maturation) organoid protocol using commercially available normal adult human dermal fibroblasts (NHDFs) as a cell source, offering a valuable model for studying in vitro tenogenesis7. Despite the fact that this model is not equivalent to in vivo T/L tissue, it still provides a more physiologically relevant system that can be used for investigating cellular differentiation mechanisms, mimicking T/L pathophysiology in vitro, and establishing T/L personalized medicine and drug screening platforms. Moreover, in the future, studies can evaluate whether the 3D organoids are suitable for scaffold-free T/L engineering by further optimization as well as utilizable for the development of scaled-up mechanically robust constructs that closely resemble the dimensions and structural and biophysical properties of native T/L tissues.

Autore in primo piano: Avanzamento dell'ingegneria tissutale tendinea con modelli 3D di organoidi

Dimostrazione della coltura di fogli cellulari autoassemblati e generazione manuale di un organoide 3D simile a tendine/legamento mediante l'utilizzo di fibroblasti dermici umani

We demonstrate a previous established and implement three-step organoid protocol using commercially available, normal human dermal fibroblasts as a cell source. The 3D organoid model holds several advantage for tissue engineering and regenerative medicine application. It mimics closely the cellular composition and organization as well as cell-to-cell and cell-to-matrix interactions of tendon tissues.The established 3D tendon-ligament organoid approach can be used as a model for tendon basic and applied research in the following areas. In vitro tenogenesis, disease mechanism, drug testing, and scaffold-free tendon tissue engineering.

Il modello di organoide 3D T/L è stato precedentemente stabilito e dimostrato qui implementando NHDF acquistato commercialmente (n=3, 3 organoidi per donatore, NHDF sono stati utilizzati nei passaggi 5-8). Il flusso di lavoro del modello è riepilogato nella Figura 1. La Figura 2 mostra immagini rappresentative a contrasto di fase della coltura NHDF durante la pre-espansione in fiasche T-75 (Figura 2A) e all'inizio e dopo 5 giorni ...

Qui, dimostriamo un modello di organoide in tre fasi (espansione bidimensionale [2D], stimolazione 2D, maturazione tridimensionale [3D]) che offre uno strumento promettente per la ricerca fondamentale sui tendini e un potenziale metodo senza scaffold per l'ingegneria tissutale tendinea.

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

Dimostriamo un protocollo di organoidi in tre fasi precedentemente stabilito e implementiamo utilizzando fibroblasti dermici umani normali disponibili in commercio come fonte cellulare. Il modello 3D di organoidi presenta diversi vantaggi per l'ingegneria tissutale e l'applicazione della medicina rigenerativa. Imita da vicino la composizione e l'organizzazione cellulare, nonché le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice dei tessuti tendinei.L'approccio consolidato dell'organoide tendineo-legamentoso 3D può essere utilizzato come modello per la ricerca di base e applicata sui tendini nelle seguenti aree. Tenogenesi in vitro, meccanismo della malattia, test farmacologici e ingegneria tissutale tendinea senza scaffold.

demonstration-self-assembled-cell-sheet-culture-manual-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

722 Views.  University of Würzburg. Dimostriamo un protocollo di organoidi in tre fasi precedentemente stabilito e implementiamo utilizzando fibroblasti dermici umani normali disponibili in commercio come fonte cellulare. Il modello 3D di organoidi presenta diversi vantaggi per l'ingegneria tissutale e l'applicazione della medicina rigenerativa. Imita da vicino la composizione e l'organizzazione cellulare, nonché le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice dei tessuti tendinei.L'approccio consolidato dell'organoide...