تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.

1. إعداد وسائل الإعلام
ملاحظة: التركيزات المذكورة في البروتوكول هي التركيزات النهائية لمكونات الوسائط. قم بإعداد جميع الوسائط في ظروف معقمة في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. استخدم في غضون 2 أسابيع.
<ol><li>وسيط صيانة hPSC: مكمل وسيط صيانة hPSC خال من وحدة التغذية (20 ميكرولتر / مل) مع وسطه الأساسي.</li>
	<li>الوسط أ: أضف البروتين المورفولوجي العظمي 4 (BMP4 ؛ 1 نانوغرام / مل) ، SB431542 (10 ميكرومتر) ، و CHIR99021 (600 نانومتر) إلى وسط قاعدة التمايز.</li>
	<li>الوسط B: أضف SB431542 (10 μM) و CHIR99021 (1.5 μM) إلى وسط قاعدة التمايز.</li>
	<li>الوسط C: أضف SB431542 (10 ميكرومتر) و CHIR99021 (1.5 ميكرومتر) و RA (1 ميكرومتر) إلى وسط قاعدة التمايز.</li>
	<li>الذروة العصبية الكاملة (NCC) المتوسطة: أضف FGF2 (10 نانوغرام / مل) ، CHIR99021 (3 ميكرومتر) ، مكمل N2 (10 ميكرولتر / مل) ، مكمل B27 (20 ميكرولتر / مل) ، مكمل L-glutamine (10 ميكرولتر / مل) ، و MEM NEAAs (10 ميكرولتر / مل) إلى الوسط العصبي القاعدي.</li>
	<li>وسط ENC: أضف GDNF (10 نانوغرام / مل) ، وحمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر) ، ومكمل N2 (10 ميكرولتر / مل) ، ومكمل B27 (20 ميكرولتر / مل) ، ومكمل L-glutamine (10 ميكرولتر / مل) ، و MEM NEAAs (10 ميكرولتر / مل) إلى الوسط العصبي القاعدي.</li>
	<li>حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) 1x: تمييع 500 mM EDTA (1000x) إلى تركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر في PBS. ملاحظة: استخدم برنامج تلفزيوني مجاني Ca2+ و Mg2+ في هذا البروتوكول ما لم ينص على خلاف ذلك.</li>
</ol>2. طلاء لوحات الثقافة
<ol><li>الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي: قم بإذابة الجليد بسرعة ، وقم بتخفيف حصة مجمدة سعة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 50 مل من DMEM: F12 المبرد عن طريق السحب بقوة باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل. قم بتغطية الآبار بمحلول مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. نضح وسط الطلاء قبل الاستخدام. لمنع جلتنة مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بتنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن واستخدم DMEM: F12 البارد لإذابة القسمة المجمدة. ملاحظة: يجب أن تبقى درجة حرارة مصفوفة الغشاء القاعدي باردة أثناء الذوبان (على الجليد) و aliquoting (أنابيب على الجليد) لمنع التخثر.</li>
	<li>ألواح مطلية ب PO / FN / laminin: قم بإعداد محلول بوليرنيثين (PO) 15 ميكروغرام / مل في PBS عن طريق تخفيف مخزون 1000x. قم بتغطية الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول PO / PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر واحتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بنضح PO / PBS وقم بتغطية الآبار عند 100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر بمحلول FN / laminin / PBS الطازج الذي يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين (FN) و 2 ميكروغرام / مل من اللامينين. يمكن استخدام الألواح بعد حضانة لا تقل عن 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. نضح FN / laminin / PBS قبل الاستخدام.</li>
</ol>3. الحفاظ على ثقافة hPSC
ملاحظة: جميع خطوات حضانة الخلايا عند 5٪ CO2 وعند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.
<ol><li>نضح وسط hPSC من ثقافة hPSC وأضف وسطا جديدا (200 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) كل يوم حتى تصبح المستعمرات ~ 80٪ متقاربة.</li>
	<li>للمرور ، قم بنضح وسط hPSC واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر. ملاحظة: من المهم استخدام برنامج تلفزيوني مجاني من Ca2+ و Mg2+ لغسل الخلايا.</li>
	<li>أضف 500 ميكرومتر EDTA (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر). استبدل غطاء اللوحة. راقب من خلال مجهر مقلوب وراقب الخلايا لانفصال حواف المستعمرة (2-4 دقائق).</li>
	<li>استخدم ماصة مصلية سعة 5 أو 10 مل لنقل نفس الحجم من وسط hPSC إلى كل بئر وحصاد الخلايا ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. ملاحظة: يعتمد وقت حضانة EDTA الأمثل على خط iPSC. تجنب السحب القوي لفصل المستعمرات لأنه يمكن أن يؤدي إلى تفكك مفرط للمستعمرة وموت الخلايا. عند المرور لبدء لوحة تمايز ، احتضان الخلايا مع EDTA لمدة 1-2 دقيقة أطول.</li>
	<li>انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط hPSC وانقلها إلى آبار صفيحة مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي جديدة. ملاحظة: لصيانة hPSC المنتظمة ، استخدم نسبة مرور 1:18 - 1:24 (1:18 تعني نقل ثلث الخلايا المنفصلة من بئر واحد من صفيحة 6 آبار إلى لوحة جديدة كاملة). لبدء لوحة التمايز ، اتبع نسبة مرور 5: 6.</li>
	<li>احتضان في 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.</li>
</ol>4. تحريض القمة العصبية
ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1 أ. ابدأ تمايز NC عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا. سيتم تحقيق ذلك في غضون 1-2 أيام عندما يتم تمرير الخلايا بنسبة 5: 6 (انظر أعلاه). ابدأ تمايز NC في اليوم 0 بخلايا hPSC متعددة القدرات وغير متمايزة تماما. لتحقيق كفاءة عالية ، يجب أن تحتوي حدود المستعمرة على الحد الأدنى من الخلايا المميزة. ممر ولوحة hPSC للتمايز عندما تكون المستعمرات كبيرة ، أو يبدأ مركز المستعمرة في التكاثف / التغميق عند مراقبته باستخدام مجهر مقلوب. يميل الانتباه إلى الالتقاء والتشكل إلى أن يكون أكثر موثوقية من عدد الخلايا المطلية لأن هذا قد يختلف اعتمادا على خط الخلية ويمكن أن يختلف من 50000-200000 لكل سم2.
<ol><li>في اليوم 0 ، استبدل وسط صيانة hPSC بوسط A يحتوي على 1 نانوغرام / مل BMP4 ، 10 ميكرومتر SB431542 ، 600 نانومتر CHIR99021 (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).</li>
	<li>في اليوم 2 ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 100٪. قم بشفط الوسط A المستهلك برفق وتغذية الخلايا ذات الوسط B التي تحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 ، 1.5 ميكرومتر CHIR99021 (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر). ملاحظة: مع نمو الثقافات أثناء تحريض NC ، قد تنفصل الخلايا عن الطبقة الأحادية الأساسية. تجنب فقدان الخلايا الزائد عن طريق إزالة الوسائط القديمة برفق وإضافة وسائط جديدة إلى جانب البئر.</li>
	<li>في اليوم 4 ، قم بتغذية الخلايا مرة أخرى بمتوسط B (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).</li>
	<li>في اليوم 6 ، استبدل الوسط B بالوسط C الذي يحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 و 1.5 ميكرومتر CHIR99021 و 1 ميكرومتر من حمض الريتينويك (400 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).</li>
	<li>في اليومين 8 و 10 ، قم بالتغذية كيوم 6.</li>
</ol>5. تشكيل كروي ENC
ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1B.
<ol><li>في اليوم 12 ، قم بشفط Medium C برفق واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر. أضف نفس الحجم من محلول انفصال الخلايا واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بتخفيف محلول انفصال الخلايا عن طريق إضافة نفس الحجم من وسط NCC الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل FGF2 ، 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 10 ميكرولتر / مل مكمل N2 ، 20 ميكرولتر / مل مكمل B27 ، 10 ميكرولتر / مل مكمل L-glutamine ، و 10 ميكرولتر / مل MEM NEAA. باستخدام ماصة مصلية ، قم بحصاد التعليق أحادي الخلية وإضافته إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.</li>
	<li>أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية.</li>
	<li>باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف 12 مل (للوحة كاملة من 6 آبار) من وسط NCC وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب ميكانيكيا لأعلى ولأسفل 1-2 مرات. انقل تعليق الخلية إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية. ملاحظة: يتم إعادة تعليق ما يقرب من 10 سم2 من خلايا ENC أحادية الطبقة في 2 مل من وسط NCC ونقلها إلى بئر واحدة من لوحة ربط منخفضة للغاية. هذا يساوي لوحة حثية NC كاملة من 6 آبار يتم نقلها إلى لوحة تثبيت كاملة منخفضة للغاية من 6 آبار.</li>
	<li>في اليوم 14 ، قم بتدوير الألواح برفق حتى يتم تجميع كرويات صغيرة في وسط كل بئر. باستخدام ماصة P1000 الدقيقة وفي حركة دائرية بطيئة ، قم باستنشاق وسيط NCC المستهلك حول محيط كل بئر. حاول تجنب إزالة الأجسام الكروية العائمة الحرة.</li>
	<li>قم بتغذية الخلايا بالحجم الأصلي لوسط NCC.</li>
</ol>6. EN التعريفي
ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1B.
<ol><li>في اليوم 15 ، قم بتطبيق نفس التقنية المستخدمة في اليوم 14 لإزالة الوسط برفق وغسل الأجسام الكروية باستخدام برنامج تلفزيوني. إزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني تجنب كروية.</li>
	<li>أضف محلول انفصال الخلايا (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) وافصل الكرات إلى خلايا مفردة عن طريق الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.</li>
	<li>باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف حجما متساويا من وسط ENC (يحتوي على 10 نانوغرام / مل GDNF ، 100 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، 10 ميكرولتر / مل N2 ملحق ، 20 ميكرولتر / مل B27 ملحق ، 10 ميكرولتر / مل مكمل L-glutamine ، و 10 ميكرولتر / مل MEM NEAA في الوسط العصبي القاعدي) إلى كل بئر وكسر الكرويات المتبقية بمقدار 2-3 جولات من الماصات الميكانيكية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ملاحظة: تجنب الإجهاد المفرط وموت الخلايا الذي يمكن أن يحدث من السحب القسري أو استخدام الماصات ذات فتحة الطرف الأصغر.</li>
	<li>أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية. باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف ~ 5-10 مل من وسط ENC وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 1-2 مرات.</li>
	<li>عد تركيز الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق وطريقة عد الخلايا مثل مقياس الدم. تنبيه: تريبان الأزرق هو مادة مسرطنة مشتبه بها. تعامل بحذر ، تخلص بشكل مناسب.</li>
	<li>أضف حجما كافيا من وسط ENC بهدف صفيحة ما يقرب من 300000-400000 خلية قابلة للحياة لكل سم2 من مساحة السطح بكثافة حوالي ~ 1000000 خلية لكل مل. نضح محلول FN / laminin / PBS من آبار اللوحة. ملاحظة: اختر تنسيق اللوحة وفقا للفحوصات المخطط لها لثقافات EN لأن هذه المرحلة تمثل خطوة إعادة الطلاء النهائية للبروتوكول. يمكن تجميد أسلاف الخلايا العصبية المعوية في اليوم 15. بعد فصل الكرات بمحلول انفصال الخلايا ، أعد تعليق السلف عند حوالي 5 × 106 خلايا / مل في وسط التجمد مثل 10٪ DMSO أو Stem-cellbanker. عند الحاجة ، قم بإذابة الثلج في وسائط ENC الدافئة باستخدام مثبط 5 μM Y-27632 ROCK. خلايا اللوحة بتنسيق اللوحة المطلوب. استبدل الوسائط ب ENC جديد بعد بضع ساعات.</li>
	<li>أضف الخلايا برفق إلى الآبار المطلية ب PO / FN / laminin. تجنب حبس الفقاعات تحت تعليق الخلية مما يمنع الخلايا من الالتصاق بطلاء PO / FN / laminin ، خاصة عند استخدام الألواح ذات حجم البئر الأصغر مثل ألواح 384 بئرا. هذا يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا.</li>
	<li>تغذية الخلايا كل يومين بوسط ENC (200 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) حتى اليوم 30-40 ، وبعد ذلك تقليل تردد التغذية (مرة أو مرتين في الأسبوع) ولكن مضاعفة حجم التغذية (إلى 400 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر). ملاحظة: هذا مهم لأن الإفراط في إزالة وإضافة الوسائط يمكن أن يسهل انفصال الثقافة العصبية عن سطح الآبار. لمنع الانفصال بشكل مستقبلي خاصة بالنسبة للمزارع طويلة الأجل ، استكمل ENC ب FN (2 ميكروغرام / مل) ولامينين (2 ميكروغرام / مل) مرة واحدة في الأسبوع.</li>
</ol>

اشتقاق الخلايا العصبية المعوية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+a+second+brain.">The enteric nervous system: a second brain.</a> Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).</li><li>Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+drug+discovery+for+neuropsychiatric+disorders+using+patient-specific+stem+cell+models.">Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models.</a> Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).</li><li>Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+tool+for+modeling+Parkinson's+disease.">Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest:+The+fourth+germ+layer.">Neural crest: The fourth germ layer.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).</li><li>Crane, J. F., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+and+progenitor+cells.">Neural crest stem and progenitor cells.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).</li><li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells.">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nat Med. 23, 49-59 (2017).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPSC-derived+enteric+ganglioids+model+human+ENS+development+and+function.">hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function.</a> BioRxiv. , (2022).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Schwann+cells+from+hPSCs+enables+disease+modeling+and+drug+discovery+for+diabetic+peripheral+neuropathy.">Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy.</a> Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).</li><li>Samuel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Schwann+cell+derived+melanocytes+from+hPSCs+identifies+pro-metastatic+factors+in+melanoma.">Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma.</a> BioRxiv. , (2023).</li><li>Richter, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+muscarinic+receptor+signaling+protects+human+enteric+inhibitory+neurons+against+platin+chemotherapy+toxicity.">Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity.</a> BioRxiv. , (2023).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،...

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،3،4،5،6،7. هنا ، نقدم تفاصيل عن طريقة تدريجية وقوية في المختبر للحصول على ثقافات ENS من hPSCs. تفتح هذه الثقافات المشتقة من hPSC القابلة للتطوير سبلا للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ويمكن أن توفر خلايا قابلة للزرع للطب التجديدي.
يتم اشتقاق سلالات الخلايا العصبية المعوية من خلايا القمة العصبية (NC) التي تتبع مسار تطور ENS أثناء التطور الجنيني. في الأجنة ، تظهر خلايا NC على طول هوامش الصفيحة العصبية القابلة للطي. تتكاثر وتهاجر وتؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية وخلايا شوان والخلايا الصباغية والهيكل العظمي القحفي الوجهي والخلايا العصبية المعوية والدبقية8،9،10. يعتمد قرار مصير الخلية على المنطقة المميزة على طول المحور الأمامي الخلفي الذي تخرج منه خلايا NC ، أي NC القحفي ، NC المبهم ، الجذع NC و NC العجزي. يتطور ENS من خلايا NC المبهمة والعجزية مع سيطرة الأولى على سكان الخلايا العصبية المعوية بسبب الهجرة الواسعة على طول الأمعاء واستعمار الأمعاء11.
عادة ما يتضمن اشتقاق خلايا NC من PSCs مزيجا من تثبيط SMAD المزدوج وتنشيط مسار WNT12,13. حتى وقت قريب ، تضمنت جميع بروتوكولات تحريض NC المصل وإضافات المنتجات الحيوانية الأخرى في ظروف الاستزراع. لا تقلل الوسائط غير المحددة كيميائيا من قابلية استنساخ تحريض NC فحسب ، بل تتحدى أيضا الدراسات التنموية الآلية. للتغلب على هذه التحديات ، طور Barber etal 14 بروتوكول تحريض NC باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا ، وبالتالي كان مفيدا على الطرق البديلة التي تعتمد على عوامل استبدال المصل (على سبيل المثال ، KSR) 13،14. تم الحصول على هذا عن طريق استبدال الوسائط القاعدية وتحسين بروتوكول قدمه في الأصل Fattahi et al لاشتقاق خلايا NC المعوية من hPSCs. هذا النظام المحسن هو أساس بروتوكول التمايز hPSC المعروض هنا. يبدأ بتحريض خلايا القمة العصبية المعوية (ENC) في فترة 15 يوما عن طريق التعديل الدقيق لإشارات BMP و FGF و WNT و TGFβ بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA). ثم نشتق سلالات ENS عن طريق علاج الخلايا بعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF). يتم تعريف جميع تركيبات الوسائط كيميائيا وتنتج ثقافات عصبية معوية قوية في غضون 30-40 يوما.
بالإضافة إلى نظام زراعة الخلايا أحادية الطبقة الموصوف هنا ، تم تطوير مناهج تحريض NC بديلة تستخدم الأجسام الجنينية العائمةالحرة 15,16. وقد تبين أن الخلايا المهاجرة في هذه الثقافات تعبر عن علامات NC مع مجموعة فرعية تمثل NC المبهم. تم استخدام الثقافات المشتركة مع أنسجة الأمعاء الأولية لإثراء سلائف NC المعوية في هذه الثقافات. تحتوي تركيبات الوسائط في هذه الدراسات على مجموعة من العوامل المختلفة مثل عامل نمو الأعصاب و NT3 وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. في هذه المرحلة ، ليس من الواضح تماما كيف يمكن أن تؤثر هذه العوامل على هويات الالتزام بسلائف الخلايا العصبية المعوية. لإجراء مقارنة فعالة لتحريض NC المعوي في الطبقة الأحادية والثقافات القائمة على الجسم الجنيني ، يلزم المزيد من البيانات. بالنظر إلى تخطيطات الثقافة المختلفة في هذه الاستراتيجيات ، يجب النظر في استخدام كل طريقة وتحسينها وفقا لتطبيق محدد في الاعتبار.
البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار وقد تم اختباره بنجاح من قبلنا ومن قبل الآخرين باستخدام خطوط hPSC المختلفة (المستحثة والجنينية)8،14،16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

تسليط الضوء على المؤلف: ثقافة قوية من الخلايا العصبية المعوية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

تمايز سلالات الجهاز العصبي المعوي عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Here we provide a method for generation of human enteric neurons from human pluripotent stem cells under fully defined conditions, and we use these cells in order to understand human enteric nervous system development and function. So I think human enteric nervous system development, physiology and pathophysiology has been a great challenge, and it's because of the rarity of the enteric nervous system cells and the transient nature of the neural crest progenitors, and difficulty in access to tissue and isolation of the tissue. This is a robust platform for generating authentic and functional human enteric neurons from HPSCs, and by overcoming longstanding technical challenges in tissue access, it provides scalable cultures of enteric nervous system components for disease modeling, drug discovery, and studying ENS developments and function.

يوفر هذا البروتوكول طريقة لاشتقاق القمة العصبية المعوية والخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا (الشكل 1A-B). يعتمد توليد خلايا عصبية عالية الجودة على خطوة تحريض قمة عصبية معوية فعالة. يمكن تقييم ذلك بصريا عن طريق التحقق من مورفولوجي?...

يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

نقدم هنا طريقة لتوليد الخلايا العصبية المعوية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في ظل ظروف محددة تماما ، ونستخدم هذه الخلايا من أجل فهم تطور الجهاز العصبي المعوي البشري ووظيفته. لذلك أعتقد أن تطور الجهاز العصبي المعوي البشري ، علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية كان تحديا كبيرا ، وذلك بسبب ندرة خلايا الجهاز العصبي المعوي والطبيعة العابرة لأسلاف القمة العصبية ، وصعوبة الوصول إلى الأنسجة وعزل الأنسجة. هذه منصة قوية لتوليد الخلايا العصبية المعوية البشرية الأصيلة والوظيفية من HPSCs ، ومن خلال التغلب على التحديات التقنية طويلة الأمد في الوصول إلى الأنسجة ، فإنها توفر ثقافات قابلة للتطوير لمكونات الجهاز العصبي المعوي لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية ودراسة تطورات ووظيفة ENS.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

854 Views.  University of California, San Francisco. نقدم هنا طريقة لتوليد الخلايا العصبية المعوية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في ظل ظروف محددة تماما ، ونستخدم هذه الخلايا من أجل فهم تطور الجهاز العصبي المعوي البشري ووظيفته. لذلك أعتقد أن تطور الجهاز العصبي المعوي البشري ، علم وظائف الأعضاء والفيزيولو...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: ثقافة قوية من الخلايا العصبية المعوية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To induce neural crest formation, replace the maintenance medium of the human pluripotent stem cell culture with 200 microliters of medium A per square centimeter of the well-surface. Incubate the culture under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius for two days. Gently aspirate the medium from the well-containing 100%confluence cells then pipette about 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface area.On day four, feed the cells with 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface. Incubate the cells for two more days, then replace the medium B with 400 microliters per square centimeter of medium C.

تشكيل القمم العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لأبحاث الجهاز العصبي المعوي

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To begin, take 12-day cultures of human pluripotent stem cells that have been subjected to neural crest induction. Gently aspirate medium C from the cells. Add 100 microliters of PBS per square centimeter of well surface area to wash the cells, and then remove the PBS.Add an equal volume of cell detachment solution to the cells and incubate for 30 minutes under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius. Add an equal volume of NCC medium into the plate. Then, use a serological pipette to harvest the cell suspension and transfer it to a 15-milliliter conical tube.Spin the cells at 290G for two minutes between 20 to 25 degrees Celsius. Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet. Use a 10-milliliter serological pipette to pipette 12 milliliters of NCC medium to the cell pellet.Mechanically pipette the suspension up and down to create a suspension. Then, transfer the cell suspension to an ultra low attachment plate. On day 14, gently swirl the cell culture plates to gather small spheroids at the center of each well.Use a P1000 micro pipette to slowly aspirate the spent medium from the circumference of each well. Refeed the cells with the original volume of NCC medium. On day 15, carefully remove the medium.Add PBS to the wells to wash the spheroids. Then, remove as much PBS as possible, ensuring spheroids are not disturbed. Next, add 100 microliters of cell detachment solution per square centimeter of well surface area.Incubate the cells in the solution for 30 minutes under 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. With a 10-milliliter serological pipette, add an equal volume of ENC medium to each well. Mechanically pipette the solution to break any remaining spheroids.Then transfer the cells to a 50-milliliter conical tube. Discard the supernatant after centrifuging as before. Then, resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of ENC medium.Count the concentration of viable cells using trypan blue and hemocytometer. Now, add enough volume of ENC medium to plate about 300, 000 to 400, 000 viable cells per square centimeter of surface area, and a density of about 1 million cells per milliliter. Then, aspirate the solutions from the wells.Next, add the cells to a plate with PO/FN laminin coated wells. Feed cells every other day with 200 microliters of ENC medium per square centimeter of well surface area until days 30 to 40. High quality free floating spheres with smooth surfaces were observed after neural crest induction.The spheroids expressed the neural crest marker SOX10. Neurites were observed between days 25 to 30 during the enteric neuron induction.