Çalışma, UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı ve Sandler Vakfı, March of Dimes hibe no. 1-FY18-394 ve 1DP2NS116769-01, NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2NS116769) F.F.'ye ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK121169) F.F.'ye, HM, Larry L. Hillblom Vakfı doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. NIH T32-DK007418 bursu ve UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı bağımsız doktora sonrası bursu.

1. Medya hazırlığı
NOT: Protokol boyunca belirtilen konsantrasyonlar, medya bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarıdır. Tüm ortamları steril koşullar altında laminer akış başlığında hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. 2 hafta içinde kullanın.
<ol><li>hPSC bakım ortamı: Besleyici içermeyen hPSC bakım ortamı takviyesini (20 μL/mL) temel ortamıyla karıştırın.</li>
	<li>Orta A: Farklılaşma baz ortamına kemik morfogenetik protein 4 (BMP4; 1 ng / mL), SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (600 nM) ekleyin.</li>
	<li>Orta B: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (1,5 μM) ekleyin.</li>
	<li>Orta C: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ve RA (1 μM) ekleyin.</li>
	<li>Nöral kret tam (NCC) Orta: FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.</li>
	<li>ENC Ortamı: GDNF (10 ng/mL), askorbik asit (100 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.</li>
	<li>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1x: 500 mM EDTA'yı (1000x) PBS'de 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. NOT: Aksi belirtilmedikçe bu protokol boyunca Ca2+ ve Mg2+ serbest PBS kullanın.</li>
</ol>2. Kültür plakalarının kaplanması
<ol><li>Bodrum membran matrisi kaplı plakalar: 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kuvvetlice pipetleyerek 500 μL'lik donmuş bazal membran matrisi alikotunu 50 mL soğutulmuş DMEM:F12'de hızla çözün ve seyreltin. Kuyuları seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 100 μL) ile kaplayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce kaplama ortamını aspire edin. Bazal membran matrisinin jelatinleşmesini önlemek için, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin ve donmuş alikotu çözmek için soğuk DMEM: F12 kullanın. NOT: Pıhtılaşmayı önlemek için bazal membran matris sıcaklığı, çözülme (buz üzerinde) ve alikotlama (buz üzerindeki tüpler) sırasında soğuk tutulmalıdır.</li>
	<li>PO / FN / laminin kaplı plakalar: 1000x stoğu seyrelterek PBS'de 15 μg / mL polinitin (PO) çözeltisi hazırlayın. Kuyucukları 2 cmyüzey alanı başına 100 μL PO / PBS çözeltisi ile kaplayın ve plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, PO / PBS'yi aspire edin ve kuyucukları 2 μg / mL fibronektin (FN) ve 2 μg / mL laminin içeren yeni yapılmış FN / laminin / PBS çözeltisi ile cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL'de kaplayın. Plakalar 37 °C'de en az 2 saat inkübasyondan sonra kullanılabilir. Kullanmadan önce FN / laminin / PBS'yi aspire edin.</li>
</ol>3. hPSC kültürünün bakımı
NOT: Tüm hücre inkübasyon adımları, nemlendirilmiş bir inkübatörde %5CO2 ve 37 °C'dedir.
<ol><li>hPSC kültüründen hPSC besiyerini aspire edin ve koloniler ~%80 birleşene kadar her gün taze besiyeri (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 200 μL) ekleyin.</li>
	<li>Geçiş için, hPSC ortamını aspire edin ve hücrelericm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın. NOT: Hücreleri yıkamak için Ca2+ ve Mg2+ içermeyen PBS kullanmak önemlidir.</li>
	<li>500 μM EDTA (cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL) ekleyin. Plakanın kapağını yerine takın. Ters çevrilmiş bir mikroskopla izleyin ve hücreleri koloni kenarlarının ayrılması açısından izleyin (2-4 dakika).</li>
	<li>Aynı hacimde hPSC ortamını her bir oyuğa aktarmak için 5 veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak hasat edin. NOT: Optimum EDTA inkübasyon süresi iPSC hattına bağlıdır. Aşırı koloni ayrışmasına ve hücre ölümüne yol açabileceğinden, kolonileri ayırmak için kuvvetli pipetlemeden kaçının. Bir farklılaşma plakasını başlatmak için geçerken, hücreleri EDTA ile 1-2 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>Hücreleri uygun bir hacimde hPSC ortamında yeniden süspanse edin ve yeni bir bazal membran matris kaplı plakanın kuyularına aktarın. NOT: Düzenli hPSC bakımı için 1:18 - 1:24 geçiş oranı kullanın (1:18, 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundan ayrılan hücrelerin üçte birinin tamamen yeni bir plakaya aktarılması anlamına gelir). Bir farklılaştırma plakasını başlatmak için 5:6'lık bir geçiş oranı izleyin.</li>
	<li>% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>4. Nöral kret indüksiyonu
NOT: Bu adım, Şekil 1A'da şematik olarak gösterilmiştir. Hücreler yaklaşık% 80 birleşim olduğunda NC farklılaşmasına başlayın. Bu, hücreler 5:6 oranında geçtiğinde 1-2 gün içinde elde edilecektir (yukarıya bakın). Pluripotent ve tamamen farklılaşmamış hPSC hücreleri ile 0. günde NC farklılaşmasına başlayın. Yüksek bir verimlilik için, koloni sınırları minimum farklılaşan hücrelere sahip olmalıdır. Koloniler büyük olduğunda veya ters mikroskop kullanılarak izlendiğinde koloninin merkezi kalınlaşmaya/kararmaya başladığında farklılaşma için geçiş ve plaka hPSC. Birleşme ve morfolojiye dikkat etmek, hücre hattına bağlı olarak değişebileceğinden vecm2 başına 50.000-200.000 arasında değişebileceğinden, kaplanmış hücre sayısından daha güvenilir olma eğilimindedir.
<ol><li>0. günde, hPSC bakım ortamını 1 ng/mL BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Ortam A ile değiştirin.</li>
	<li>2. günde, hücreler% 100 birleşik olmalıdır. Harcanan Ortam A'yı nazikçe aspire edin ve 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Orta B ile hücreleri besleyin. NOT: NC indüksiyonu sırasında kültürler büyüdükçe, hücreler alttaki tek tabakadan ayrılabilir. Eski ortamı nazikçe çıkararak ve kuyu tarafına taze ortam ekleyerek fazla hücre kaybını önleyin.</li>
	<li>4. günde, hücreleri tekrar Ortam B (cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) ile besleyin.</li>
	<li>6. günde, orta B'yi 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ve 1 μM retinoik asit (cm2 kuyu yüzey alanı başına 400 μL ortam) içeren Orta C ile değiştirin.</li>
	<li>8. ve 10. günlerde 6. gün olarak besleyin.</li>
</ol>5. ENC küresel oluşumu
NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.
<ol><li>12. günde, Orta C'yi nazikçe aspire edin ve hücrelericm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın. Aynı hacimde hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve% 5 CO2 ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10 ng/mL FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve 10 μL/mL MEM NEAA içeren aynı hacimde NCC ortamı ekleyerek hücre ayırma solüsyonunu seyreltin. Serolojik bir pipet kullanarak, tek hücreli süspansiyonu hasat edin ve 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, 12 mL (tam 6 oyuklu bir plaka için) NCC ortamı ekleyin ve 1-2 kez mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın. NOT: Yaklaşık 10cm2 ENC tek katmanlı hücreler, 2 mL NCC ortamında yeniden süspanse edilir ve ultra düşük bir bağlantı plakasının bir kuyucuğuna aktarılır. Bu, tam 6 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasına aktarılan tam 6 oyuklu bir NC indüksiyon plakasına eşittir.</li>
	<li>14. günde, her bir oyuğun ortasında küçük küreler toplanana kadar plakaları hafifçe döndürün. Bir P1000 mikropipet kullanarak ve yavaş dairesel hareketlerle, harcanan NCC ortamını her bir oyuğun çevresi boyunca aspire edin. Serbest yüzen sferoidleri çıkarmaktan kaçının.</li>
	<li>Hücreleri orijinal NCC ortamı hacmiyle besleyin.</li>
</ol>6. EN indüksiyonu
NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.
<ol><li>15. günde, ortamı nazikçe çıkarmak ve sferoidleri PBS ile yıkamak için 14. günde kullanılan tekniğin aynısını uygulayın. Sferoidlerden kaçınarak mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.</li>
	<li>Hücre ayırma çözeltisi ekleyin (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 100 μL) ve sferoidleri% 5 CO2 ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe ederek tek hücrelere ayırın.</li>
	<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, eşit hacimde ENC ortamı ekleyin (10 ng/mL GDNF, 100 μM askorbik asit, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve nörobazal ortamda 10 μL/mL MEM NEAA içerir) her bir oyuğa ve kalan sferoidleri 2-3 tur mekanik pipetleme ile kırın. Hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. NOT: Zorla pipetleme veya daha küçük uç açıklığına sahip pipetlerin kullanılmasından kaynaklanabilecek aşırı stres ve hücre ölümünden kaçının.</li>
	<li>Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, ~ 5-10 mL ENC ortamı ekleyin ve 1-2 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Tripan mavisi ve hemositometre gibi bir hücre sayma yöntemi kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın. DİKKAT: Tripan mavisi şüpheli bir kanserojendir. Dikkatli tutun, uygun şekilde atın.</li>
	<li>mL başına yaklaşık ~ 1.000.000 hücre yoğunluğunda cm2 yüzey alanı başına yaklaşık 300.000-400.000 canlı hücre kaplamayı hedefleyen yeterli miktarda ENC ortamı ekleyin. Plakanın kuyularından FN / laminin / PBS çözeltisini aspire edin. NOT: EN kültürleri için planlanan tahlillere göre plaka formatını seçin, çünkü bu aşama protokolün son yeniden kaplama adımını işaret eder. Enterik nöron progenitörleri 15. günde dondurulabilir. Küreleri hücre ayırma çözeltisi ile ayırdıktan sonra, progenitörleri %10 DMSO veya Kök hücre bankacısı gibi dondurucu ortamda yaklaşık 5 x10 6 hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Gerektiğinde, 5 μM Y-27632 ROCK inhibitörü ile ılık ENC ortamında çözdürün. İstenilen plaka formatında plaka hücreleri. Ortamı birkaç saat sonra taze ENC ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri yavaşça PO / FN / laminin kaplı oyuklara ekleyin. Özellikle 384 oyuklu plakalar gibi daha küçük kuyu boyutuna sahip plakalar kullanıldığında, hücrelerin PO / FN / laminin kaplamaya bağlanmasını önleyen hücre süspansiyonunun altında kabarcıkların sıkışmasını önleyin. Bu hücre ölümüne yol açabilir.</li>
	<li>Hücreleri 30-40. güne kadar ENC ortamı(cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL) ile her gün besleyin, ardından besleme sıklığını azaltın (haftada bir veya iki kez), ancak besleme hacmini iki katına çıkarın (kuyu yüzey alanınıncm2'si başına 400 μL ortam). NOT: Bu, ortamın aşırı çıkarılması ve eklenmesi, nöronal kültürün kuyucukların yüzeyinden ayrılmasını kolaylaştırabileceğinden önemlidir. Özellikle uzun süreli kültürler için dekolmanı prospektif olarak önlemek için, ENC'yi haftada bir kez FN (2 μg / mL) ve laminin (2 μg / mL) ile destekleyin.</li>
</ol>

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Enterik Nöronların Türetilmesi

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+a+second+brain.">The enteric nervous system: a second brain.</a> Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).</li><li>Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+drug+discovery+for+neuropsychiatric+disorders+using+patient-specific+stem+cell+models.">Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models.</a> Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).</li><li>Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+tool+for+modeling+Parkinson's+disease.">Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest:+The+fourth+germ+layer.">Neural crest: The fourth germ layer.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).</li><li>Crane, J. F., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+and+progenitor+cells.">Neural crest stem and progenitor cells.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).</li><li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells.">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nat Med. 23, 49-59 (2017).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPSC-derived+enteric+ganglioids+model+human+ENS+development+and+function.">hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function.</a> BioRxiv. , (2022).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Schwann+cells+from+hPSCs+enables+disease+modeling+and+drug+discovery+for+diabetic+peripheral+neuropathy.">Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy.</a> Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).</li><li>Samuel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Schwann+cell+derived+melanocytes+from+hPSCs+identifies+pro-metastatic+factors+in+melanoma.">Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma.</a> BioRxiv. , (2023).</li><li>Richter, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+muscarinic+receptor+signaling+protects+human+enteric+inhibitory+neurons+against+platin+chemotherapy+toxicity.">Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity.</a> BioRxiv. , (2023).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC'lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC'lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerin...

Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir1. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardanizole edilmesi zor olanlar olmak üzere, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir kaynağını sağlamada son derece faydalı olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7. Burada, hPSC'lerden ENS kültürleri elde etmek için aşamalı ve sağlam bir in vitro yöntemin ayrıntılarını sunuyoruz. Bu ölçeklenebilir hPSC'den türetilmiş kültürler, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taraması için yollar açar ve rejeneratif tıp için nakledilebilir hücreler sağlayabilir.
Enterik nöron soyları, embriyogenez sırasında ENS gelişim yolunu izleyen nöral krest (NC) hücrelerinden türetilir. Embriyolarda, NC hücreleri katlanan nöral plakanın kenarları boyunca ortaya çıkar. Çoğalırlar, göç ederler ve duyusal nöronlar, Schwann hücreleri, melanositler, kraniyofasiyal iskelet ve enterik nöronlar ve glia 8,9,10 dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipine yol açarlar. Hücre kaderi kararı, NC hücrelerinin çıktığı ön-arka eksen boyunca farklı bölgeye, yani kraniyal NC, vagal NC, gövde NC ve sakral NC'ye bağlıdır. ENS, vagal ve sakral NC hücrelerinden gelişir ve birincisi, bağırsağın uzunluğu boyunca geniş göç ve bağırsağı kolonize etmesi nedeniyle enterik nöronların popülasyonuna hakimdir11.
NC hücrelerinin PSC'lerden türetilmesi genellikle ikili SMAD inhibisyonu ve WNT yolu aktivasyonunun bir kombinasyonunu içerir12,13. Yakın zamana kadar, tüm NC indüksiyon protokolleri, kültür koşullarında serum ve diğer hayvansal ürün katkı maddelerini içeriyordu. Kimyasal olarak tanımlanmamış ortamlar sadece NC indüksiyonunun tekrarlanabilirliğini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda mekanik gelişimsel çalışmalara da meydan okur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Barber ve ark.14, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarını kullanarak bir NC indüksiyon protokolü geliştirdi ve bu nedenle serum replasman faktörlerine (örneğin, KSR) dayanan alternatif yöntemlere göre avantajlıydı13,14. Bu, bazal medya replasmanları ve orijinal olarak Fattahi ve arkadaşları tarafından hPSC'lerden enterik NC hücreleri türetmek için sunulan bir protokolün optimize edilmesiyle elde edildi. Bu geliştirilmiş sistem, burada sunulan hPSC farklılaşma protokolünün temelidir. Retinoik aside (RA) ek olarak BMP, FGF, WNT ve TGFβ sinyallerinin hassas modülasyonu ile 15 günlük bir süre içinde enterik nöral krest (ENC) hücrelerinin indüksiyonu ile başlar. Daha sonra, hücreleri glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) ile tedavi ederek ENS soylarını türetiriz. Tüm besiyeri bileşimleri kimyasal olarak tanımlanır ve 30-40 gün içinde sağlam enterik nöronal kültürler verir.
Burada tarif edilen tek katmanlı hücre kültürü sistemine ek olarak, serbest yüzen embriyoid cisimciklerini kullanan alternatif NC indüksiyon yaklaşımları geliştirilmiştir 15,16. Bu kültürlerdeki göçmen hücrelerin, vagal NC'yi temsil eden bir alt küme ile NC belirteçlerini eksprese ettiği gösterilmiştir. Primer barsak dokusu ile ko-kültürler, bu kültürlerde enterik NC öncüllerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışmalardaki medya kompozisyonları, sinir büyüme faktörü, NT3 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör gibi farklı faktörlerin bir kombinasyonunu içerir. Bu aşamada, bu faktörlerin enterik nöron öncü bağlılık kimliklerini nasıl etkileyebileceği tam olarak açık değildir. Tek tabakalı enterik NC indüksiyonunun ve embriyoid-vücut bazlı kültürlerin etkili bir şekilde karşılaştırılması için daha fazla veri gereklidir. Bu stratejilerdeki farklı kültür düzenleri göz önüne alındığında, her bir yöntemin kullanımı göz önünde bulundurularak belirli bir uygulamaya göre dikkate alınmalı ve optimize edilmelidir.
Burada sunulan protokol tekrarlanabilir ve biz ve diğerleri tarafından farklı hPSC (indüklenmiş ve embriyonik) hatları kullanılarak başarıyla test edilmiştir 8,14,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS'nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC'lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Yazar Spotlight: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden İnsan Enterik Nöronlarının Sağlam Kültürü

Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

Bu protokol, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöral krest ve enterik nöronlar türetmek için bir yöntem sağlar (Şekil 1A-B). Yüksek kaliteli nöronların üretilmesi, verimli bir enterik nöral krest indüksiyon adımına bağlıdır. Bu, Şekil 1C'de görüldüğü gibi yaklaşık 0,1 - 0,4 mm boyutunda pürüzsüz yüzeylerle yuvarlak görünmesi gereken serbest yüzen kürelerin morf...

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Burada, tam olarak tanımlanmış koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerinden insan enterik nöronlarının üretilmesi için bir yöntem sunuyoruz ve bu hücreleri insan enterik sinir sistemi gelişimini ve işlevini anlamak için kullanıyoruz. Bu yüzden insan enterik sinir sistemi gelişiminin, fizyolojisinin ve patofizyolojisinin büyük bir zorluk olduğunu düşünüyorum ve bunun nedeni enterik sinir sistemi hücrelerinin nadir olması ve nöral krest progenitörlerinin geçici doğası ve dokuya erişim ve dokunun izolasyonundaki zorluktur. Bu, HPSC'lerden otantik ve işlevsel insan enterik nöronları üretmek için sağlam bir platformdur ve doku erişiminde uzun süredir devam eden teknik zorlukların üstesinden gelerek, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve ENS gelişmelerini ve işlevini incelemek için enterik sinir sistemi bileşenlerinin ölçeklenebilir kültürlerini sağlar.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

903 Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Burada, tam olarak tanımlanmış koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerinden insan enterik nöronlarının üretilmesi için bir yöntem sunuyoruz ve bu hücreleri insan enterik sinir sistemi gelişimini ve işlevini anlamak için kullanıyoruz. Bu yüzden insan enterik sinir sistemi gelişiminin, fizyolojisinin ve patofizyolojisinin büyük bir zorluk olduğunu düşünüyorum ve bunun nedeni enterik sinir sistemi hücrelerinin nadir olması ve nöral krest progenitörlerinin g...

Video: Yazar Spotlight: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden İnsan Enterik Nöronlarının Sağlam Kültürü

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.