تعترف APL بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (EF1935265) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-EB030031 و R21-AR080363) ، ومكتب أبحاث الجيش (80523-BB)

وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
1. تفاعلات CFE السائبة في وجود حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (SUVs)
<ol><li>إعداد سيارات الدفع الرباعي ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.<ol><li>تحضير 5 مللي متر 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) سيارات الدفع الرباعي في قنينة زجاجية عن طريق نقل 76 ميكرولتر من محلول مخزون الملوثات العضوية الثابتة 25 ملغم / مل المذاب في الكلوروفورم.</li>
		<li>أثناء تدوير القارورة الزجاجية برفق ، قم بنفخ تيار لطيف من الأرجون في القارورة لتشكيل طبقة من الدهون المجففة في الأسفل. بعد ذلك ، قم بنقل القارورة الزجاجية إلى مجفف مع غطاء مشدود بشكل فضفاض لتبخر الكلوروفورم الزائد.</li>
		<li>الحفاظ على قارورة الزجاج في المجفف لمدة 1 ساعة. ثم أضف 0.5 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء لإذابة طبقة الدهون والدوامة لمدة 2 دقيقة تقريبا.</li>
		<li>قم بإعداد جهاز بثق صغير عن طريق نقع دعامتين للمرشح في الماء منزوع الأيونات ووضعهما على كل من دعامات الغشاء الداخلي. بعد ذلك ، انقع مرشح البولي كربونات 100 نانومتر وضعه بين دعامتي الغشاء الداخليين المثبتين معا بواسطة الغلاف الخارجي للطارد وصامولة التجنيب. ضع هذا الإعداد في حامل الطارد.</li>
		<li>اغسل حقنتين محكمتين للغاز سعة 1 مل 3 مرات بماء منزوع الأيونات فائق النقاء.</li>
		<li>قم بتحميل عينة مزيج الماء الدهني في واحدة من المحاقن المانعة لتسرب الغاز سعة 1 مل وضعها في أحد طرفي الطارد الصغير باستخدام مشابك ذراع التأرجح لتثبيت المحقنة في مكانها. أدخل المحقنة الثانية في الطرف الآخر من الطارد الصغير وتأكد من الضغط عليها تماما. ملاحظة: عند تحميل المحقنة بمزيج الماء الدهني ، تأكد من عدم وجود هواء في المحقنة قبل تمريرها عبر آلة البثق الصغيرة.</li>
		<li>مرر مزيج الماء الدهني برفق من المحقنة الأصلية إلى المحقنة الفارغة من خلال جهاز الطارد الصغير. كرر هذه الخطوة 11 مرة لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. انقل سيارات الدفع الرباعي إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. ملاحظة: يمكن تخزين حل سيارات الدفع الرباعي في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.</li>
	</ol></li>
	<li>تجميع تفاعل CFE<ol><li>قم بتجميع تفاعل CFE باتباع بروتوكول التعبير الخالي من الخلايا الذي توفره الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة مفصلة في ما يلي.</li>
		<li>امزج 10 ميكرولتر من المحلول 1 (يحتوي على الأحماض الأمينية ، NTPs ، tRNAs والركائز للإنزيمات ، والمخزن المؤقت الضروري) ، 1 ميكرولتر من المحلول 2 (البروتينات في 20٪ جلسرين) ، 2 ميكرولتر من المحلول 3 (الريبوسوم (20 ميكرومتر)) ، كمية مناسبة من ترميز الحمض النووي للذوبان sfGFP-sfCherry (1-10) 27 (يشار إليه باسم sfGFP القابل للذوبان فيما بعد) ، WT-GluR0-sfGFP ، أو PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 نانوغرام / 1000 زوج قاعدة) ، 1 ميكرولتر مثبط RNAse الفئران ، و 4 ميكرولتر من محلول 5 mM SUV للبروتينات الغشائية أو 4 ميكرولتر ماء للبروتينات القابلة للذوبان.</li>
		<li>اجعل الحجم النهائي للتفاعل يساوي 20 ميكرولتر بإضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء. ملاحظة: عند تجميع نظام CFE ، يجب الاحتفاظ بجميع المكونات على الجليد. جميع المواد حساسة لدرجة الحرارة ويمكن أن تتحلل إذا وصلت إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol></li>
	<li>حضانة تفاعل CFE ورصده<ol><li>انقل محلول CFE إلى صفيحة مخروطية القاع على شكل حرف V مكونة من 96 بئرا. لمنع التبخر أثناء التفاعل ، قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب.</li>
		<li>احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في قارئ لوحة لمدة 4-5 ساعات أثناء مراقبة تفاعل CFE عن طريق قياس إشارة GFP بكسب 100 عند 488 نانومتر / 528 نانومتر أطوال موجية للإثارة / الانبعاث كل 2 دقيقة.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تفاعلات CFE المغلفة في GUVs
<ol><li>تحضير محلول المخزن المؤقت الخارجي GUV<ol><li>في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، امزج 1.5 ميكرولتر من 1 متر سبيرميدين ، 37.5 ميكرولتر من 100 مللي متر ATP ، 25 ميكرولتر من 100 مللي متر GTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر CTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر UTP ، 25 ميكرولتر من 1 M فوسفات الكرياتين ، 18 ميكرولتر من 1 M خلات المغنيسيوم ، 93.33 ميكرولتر من 3 M غلوتامات البوتاسيوم ، 50 ميكرولتر من 1 M HEPES KOH (درجة الحموضة 7.4) ، 1.15 ميكرولتر من 332 mM حمض الفولينيك ، 100 ميكرولتر من 2 M الجلوكوز ، و 50 ميكرولتر من محلول المخزون من خليط 6 mM من كل من الأحماض الأمينية العشرين (أعدت باتباع البروتوكول الذي وصفه Sun et al.28).</li>
		<li>ارفع الحجم النهائي للمحلول إلى 1 مل عن طريق إضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء. ملاحظة: يجب حفظ جميع المكونات على الجليد. أضف خليط الأحماض الأمينية في النهاية لتجنب نضوب الأحماض الأمينية28. يمكن تسعير المحلول في حصص 330 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	</ol></li>
	<li>تحضير خليط الدهون في الزيت ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.<ol><li>في غطاء الدخان ، امزج 17.3 ميكرولتر من محلول مخزون POPC 25 مجم / مل و 1.08 ميكرولتر من 50 مجم / مل بولي (بوتادين) -ب-بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO-b-PBD) كوبوليمر في قنينة زجاجية سعة 15 مل. ملاحظة: يحتوي محلول الدهون النهائي في الزيت على 0.5 مليمتر دهون مع 95٪ و 5٪ POPC و PEO-b-PBD ، على التوالي. تم استخدام PEO-b-PBD لتعزيز استقرار الغشاء أثناء التعبير عن البروتين ولكن تم الاحتفاظ به عند نسبة مولية منخفضة لتقليل ميل البوليمر المشترك إلى التجمع في مذيلات منفصلة عن جزيئات الدهون29,30.</li>
		<li>قم بنفخ تيار لطيف من غاز الأرجون بعناية في القارورة الزجاجية أثناء تدوير القارورة لتبخير الكلوروفورم.</li>
		<li>ماصة 1.2 مل من الزيت المعدني الخفيف في قنينة زجاجية سعة 15 مل تحتوي على الدهون المجففة.</li>
		<li>خلط الدهون والزيت عن طريق الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10-20 ثانية. سيبدو مزيج البوليمر المشترك الدهني المذاب غائما.</li>
		<li>لضمان إذابة جميع الركام الدهني الممكن في الزيت بالكامل وتشتيته في جميع أنحاء الزيت ، ضع القارورة الزجاجية في الفرن على حرارة حوالي 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الدوامة لمدة 10-20 ثانية إضافية بأقصى سرعة.</li>
	</ol></li>
	<li>تجميع وتغليف تفاعل CFE (يلخص الشكل 1 الخطوات التالية).<ol><li>تحضير 300 ميكرولتر من محلول GUV الخارجي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل عن طريق خلط 270 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت الخارجي CFE المحضر في الخطوة 2.1 ، و 15 ميكرولتر من 5 M NaCl ، و 15 ميكرولتر من 4.5 M KCl. ملاحظة: في هذه الخطوة ، أضف 0.45 ميكرولتر من 1 M 1،4-ديثيوثريتول (DTT) إلى محلول GUV الخارجي. الغرض من إضافة كلوريد الصوديوم و KCl هو ضبط أسمولية المحلول الخارجي لمطابقته مع محلول CFE الداخلي. يعتمد الحجم الدقيق لكلوريد الصوديوم و KCl على تعديل الأسمولية المطلوب. يمكن للمرء إضافة إما كلوريد الصوديوم أو KCl أو كليهما لضبط الأسمولية.</li>
		<li>ماصة بلطف 300 ميكرولتر من خليط الدهون في الزيت فوق محلول GUV الخارجي. ملاحظة: عند إضافة مزيج الزيت الدهني ، من المهم ألا يختلط الزيت بالمحلول الخارجي المائي. بعد الإضافة ، يجب أن يكون هناك واجهة مرئية بين خليط الدهون في الزيت والمحلول الخارجي GUV.</li>
		<li>احتضان واجهة الزيت والماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة للسماح للطبقة الأحادية الدهنية بالتشكل والاستقرار عند الواجهة.</li>
		<li>وفي الوقت نفسه ، اتبع القسم 1.2.1 لتجميع تفاعل CFE الذي يحتوي على الحمض النووي البلازميد الذي يشفر متغيرات بروتين الغشاء أو GFP القابل للذوبان. استبدل محلول 4 ميكرولتر من 5 مللي متر من محلول SUV أو الماء ب 4 ميكرولتر من 1 متر سكروز. سيكون هذا التفاعل هو الحل الداخلي GUV. ملاحظة: تم استخدام مقياس الأسمومتر لقياس الأسمولية للحلول الداخلية والخارجية. ثم تم تعديل أسمولية المحلول الخارجي وفقا لذلك بإضافة كلوريد الصوديوم أو الماء. عادة ما تكون الأسمولية لتفاعل CFE حوالي 1600 mOsm / Kg. تؤدي إضافة السكروز إلى التفاعل إلى زيادة كثافة المحلول الداخلي ، مما يسمح للحويصلات بالانتقال عبر واجهة الزيت والماء أثناء خطوة الطرد المركزي. بديل السكروز هو محلول تدرج الكثافة Opti-Prep.</li>
		<li>أضف 600 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على تفاعل CFE والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لمدة ~ 1 دقيقة لاستحلاب التفاعل في محلول الدهون في الزيت وتشكيل طبقة أحادية دهنية حول الخلايا الاصطناعية. ملاحظة: يجب ألا يحتوي الحل النهائي على أي فقاعات ويجب أن يبدو معتما.</li>
		<li>ماصة بلطف مستحلب المحلول الداخلي أعلى طبقة الزيت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل حيث تم إعداد واجهة الزيت والماء. ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الواجهة أو زعزعة استقرارها.</li>
		<li>جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: تم تحسين سرعة الطرد المركزي لهذا البروتوكول. أبلغ Adir et al.31 عن سرعة طرد مركزي مختلفة.</li>
		<li>بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزالة الزيت الزائد والمحلول الخارجي بعناية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة. قم بإزالة المحلول الخارجي حتى يصبح الحجم المتبقي حوالي 100 ميكرولتر. ملاحظة: عادة ما تكون حبيبات GUVs مرئية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ومع ذلك ، فإن عدم وجود حبيبات مرئية لا يعني بالضرورة عدم وجود عائد GUV. بدلا من استخدام الماصة ، يمكن إزالة الزيت الزائد الموجود أعلى المحلول الخارجي عن طريق الشفط. من الأهمية بمكان ضمان إزالة محلول الدهون في الزيت تماما. يمكن أن يتسبب تلوث الزيت في محلول GUV في الحصول على صور منخفضة الجودة.</li>
		<li>أعد تعليق حبيبات GUV في محلول 100 ميكرولتر المتبقي عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، انقل محلول GUV إلى صفيحة سفلية مسطحة نظيفة 96 جيدا لاحتضانها.</li>
	</ol></li>
</ol>3. مغلفة CFE تفاعل الحضانة والتصوير
<ol><li>قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب لمنع التبخر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعات. يمكن للمرء استخدام قارئ الألواح واتباع الخطوة 1.3.2 لإعداد قارئ اللوحة لخطوة الحضانة.</li>
	<li>بمجرد انتهاء الحضانة ، ضع لوحة البئر 96 على مرحلة التصوير لمجهر مقلوب مزود بكاميرا EMCCD (أو كاميرا sCMOS) ، ليزر يتم التحكم فيه DAQ-MX (أو نظام دمج ليزر متكامل) ، وقرص دوار CSU-X1 متحد البؤر (أو بؤري مسح بالليزر). ركز على أي عائد استثمار يحتوي على GUVs والتقط صورا بطول موجي مثير يبلغ 488 نانومتر باستخدام هدف Plan-Apochromat 60 x / 1.4 NA.</li>
	<li>احفظ صور GUVs بتنسيق .tiff.</li>
	<li>افتح الصور في برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال ، ImageJ أو Fiji). افتح لوحة إعداد السطوع / التباين . اضبط السطوع والتباين على الإعدادات المناسبة التي تجعل البروتينات الفلورية مرئية.</li>
	<li>إذا كان الهدف هو مقارنة شدة الإشارة للبروتينات المعبر عنها المختلفة ، فقم أولا بتكديس الصور الفردية ل GUVs التي تحتوي على بروتينات مختلفة باستخدام لوحة Images to Stack الموجودة أسفل القائمة الفرعية Image > Stacks . بعد ذلك ، اضبط السطوع والتباين لجميع الصور باستخدام لوحة السطوع / التباين .</li>
</ol>

التعبير الخالي من الخلايا للبروتينات الغشائية في الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells:+Forging+one+from+many.">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li><li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis.">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Past,+present+and+future.">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells.">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).</li><li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions.">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture.">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes.">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236 (2021).</li><li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis.">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).</li><li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities.">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells.">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles.">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems.">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li><li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li><li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis.">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li><li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems:+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes.">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li><li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems.">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917 (2019).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly.">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).</li><li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins.">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li><li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor.">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells.">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy.">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104 (2023).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تقريبا أي عملية خلوية تعتمد على نقل الجزيئات أو المعلومات عبر غشاء الخلية ، مثل إشارات الخلية أو إثارة الخلية ، تتطلب بروتينات غشائية. وهكذا ، أصبحت إعادة تكوين البروتينات الغشائية عنق الزجاجة الرئيسي في تحقيق تصميمات الخلايا الاصطناعية المختلفة لتطبيقات مختلفة. تتطلب إعادة تكوين البرو?...

اكتسبت البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى اهتماما متزايدا على مدى العقد الماضي كمجال ناشئ مع العديد من التطبيقات المحتملة في الهندسة الحيوية ، وتوصيل الأدوية ، والطب التجديدي1،2. اجتذب تطوير الخلايا الاصطناعية كحجر زاوية في البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى ، على وجه الخصوص ، مجموعة واسعة من المجتمعات العلمية بسبب التطبيقات الواعدة للخلايا الاصطناعية بالإضافة إلى خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية الشبيهة بالخلايا التي تسهل الدراسات الفيزيائية الحيوية في المختبر 3،4،5،6. غالبا ما يتم تصميم الخلايا الاصطناعية في حويصلات أحادية الصفيحة عملاقة بحجم الخلية (GUVs) حيث يتم إعادة إنشاء عمليات بيولوجية مختلفة. إعادة تكوين الهيكل الخلويالخلوي للخلية 7,8 ، وتجديد الطاقة المعتمدة على الضوء9 ، والاتصالات الخلوية10,11 ، والاستشعار الحيوي12 هي أمثلة على الجهود المبذولة لإعادة بناء السلوكيات الشبيهة بالخلايا في الخلايا الاصطناعية.
بينما تعتمد بعض العمليات الخلوية على البروتينات القابلة للذوبان، فإن العديد من خصائص الخلايا الطبيعية، مثل الاستشعار والتواصل، غالبا ما تستخدم البروتينات الغشائية، بما في ذلك القنوات الأيونية والمستقبلات والناقلات. التحدي الرئيسي في تطوير الخلايا الاصطناعية هو إعادة تكوين البروتينات الغشائية. على الرغم من أن الطرق التقليدية لإعادة تكوين البروتين الغشائي في طبقات الدهون المزدوجة تعتمد على التنقية بوساطة المنظفات ، إلا أن هذه الطرق شاقة وغير فعالة للبروتينات السامة لمضيف التعبير ، أو غالبا ما تكون غير مناسبة لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs13.
طريقة بديلة للتعبير عن البروتين هي أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE). كانت أنظمة CFE أداة قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتعبير في المختبر عن البروتينات المختلفة باستخدام إما تحلل الخلية أو آلة ترجمة النسخالمنقى 14. يمكن أيضا تغليف أنظمة CFE في GUVs ، مما يسمح بتفاعلات تخليق البروتين المجزأة التي يمكن برمجتها لتطبيقات مختلفة ، مثل إنشاء خلايا اصطناعية لحصاد الضوء9 أو أجهزة استشعار حيوية حساسة ميكانيكيا15,16. على غرار طرق التعبير عن البروتين المؤتلف ، يمثل تعبير البروتين الغشائي تحديا في أنظمة CFE17. يعد التجميع والطي الخاطئ وعدم وجود تعديل ما بعد الترجمة في أنظمة CFE من الاختناقات الرئيسية التي تعيق تخليق البروتين الغشائي الناجح باستخدام أنظمة CFE. ترجع صعوبة إعادة تكوين البروتين الغشائي من أسفل إلى أعلى باستخدام أنظمة CFE جزئيا إلى عدم وجود مسار حيوي معقد للبروتين الغشائي يعتمد على ببتيدات الإشارة وجزيئات التعرف على الإشارات والترانسلوكونات وجزيئات المرافقة. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، اقترحت دراسات متعددة أن وجود هياكل غشائية مثل الميكروسومات أو الجسيمات الشحمية أثناء الترجمة يعزز التعبير الناجح للبروتين الغشائي18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، وجد Eaglesfield et al. و Steinküher et al. أن إدراج مجالات محددة كارهة للماء تعرف باسم ببتيدات الإشارة في المحطة N لبروتين الغشاء يمكن أن يحسن بشكل كبير تعبيره22,23. إجمالا ، تشير هذه الدراسات إلى أنه يمكن التغلب على التحدي المتمثل في إعادة تكوين البروتين الغشائي في الخلايا الاصطناعية إذا حدثت ترجمة البروتين في وجود غشاء GUV وإذا تم استخدام ببتيد إشارة N-terminal المناسب.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتغليف تخليق البروتين باستخدام تفاعلات CFE للعناصر المؤتلفة (PURE) لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs. يتم اختيار مستقبلات الغلوتامات البكتيرية24 (GluR0) كبروتين غشاء نموذجي ، ويتم دراسة تأثير ببتيد الإشارة الطرفية N على إعادة تكوين الغشاء. تم التحقيق في تأثير ببتيد إشارة البروتيورهودوبسين ، الذي ثبت أنه يحسن كفاءة إعادة تكوين البروتين الغشائي بواسطة Eaglesfield et al.22 ، من خلال بناء متغير متحور من GluR0 يشار إليه باسم PRSP-GluR0 وتتم مقارنة تعبيره وتوطين الغشاء مع GluR0 من النوع البري (يشار إليه باسم WT-GluR0 فيما بعد) الذي يؤوي ببتيد الإشارة الأصلي. يعتمد هذا البروتوكول على طريقة المستحلب المقلوب25 مع التعديلات التي تجعله قويا لتغليف CFE. في الطريقة المقدمة ، يتم استحلاب تفاعلات CFE أولا باستخدام محلول دهني في زيت يولد قطرات بحجم ميكرون تحتوي على نظام CFE ويتم تثبيتها بواسطة الطبقة الأحادية للدهون. ثم توضع قطرات المستحلب فوق واجهة الزيت والماء المشبعة بطبقة أحادية دهنية أخرى. ثم تجبر قطرات المستحلب على الانتقال عبر واجهة الزيت والماء عبر قوة الطرد المركزي. من خلال هذه العملية ، تحصل القطرات على طبقة أحادية أخرى ، وبالتالي تولد حويصلة دهنية ثنائية الطبقة. ثم يتم تحضين GUVs التي تحتوي على تفاعل CFE ، حيث يتم التعبير عن بروتين الغشاء ودمجه في غشاء GUV. على الرغم من أن هذا البروتوكول مخصص للتعبير الخالي من الخلايا ل GluR0 ، إلا أنه يمكن استخدامه للتوليف الخالي من الخلايا لبروتينات غشائية أخرى أو تطبيقات الخلايا الاصطناعية المختلفة مثل إعادة تكوين الهيكل الخلوي أو دراسات اندماج الغشاء26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

تعد أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE) أدوات قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتقليد الحيوي للوظائف الخلوية مثل الاستشعار الحيوي وتجديد الطاقة في الخلايا الاصطناعية. ومع ذلك ، تتطلب إعادة بناء مجموعة واسعة من العمليات الخلوية إعادة تكوين ناجحة للبروتينات الغشائية في غشاء الخلايا الاصطناعية. في حين أن التعبير عن البروتينات القابلة للذوبان عادة ما يكون ناجحا في أنظمة CFE الشائعة ، فقد ثبت أن إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الطبقات الثنائية الدهنية للخلايا الاصطناعية يمثل تحديا. هنا ، يتم عرض طريقة لإعادة تكوين بروتين غشاء نموذجي ، مستقبلات الغلوتامات البكتيرية (GluR0) ، في حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كخلايا اصطناعية نموذجية تعتمد على تغليف وحضانة تفاعل CFE داخل الخلايا الاصطناعية. باستخدام هذه المنصة ، تم إثبات تأثير استبدال ببتيد الإشارة N-terminal ل GluR0 بببتيد إشارة proteorhodopsin على النقل المشترك الناجح ل GluR0 إلى أغشية GUVs الهجينة. توفر هذه الطريقة إجراء قويا يسمح بإعادة تكوين البروتينات الغشائية المختلفة في الخلايا الاصطناعية الخالية من الخلايا.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

تسليط الضوء على المؤلف: إعادة تكوين البروتين الغشائي في الخلايا الاصطناعية

إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

قبل تغليف تفاعلات CFE ، تم التعبير عن نوعين مختلفين من GluR0-sfGFP يؤويان ببتيدات إشارة أصلية وبروتيورهودوبسين (يتم عرض تسلسل ببتيد الإشارة في الجدول التكميلي 1) ، وتم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان بشكل فردي في تفاعلات مجمعة ، وتم رصد تعبيرهما عن طريق اكتشاف إشارة sfGFP باستخدام ق?...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول طريقة المستحلب المقلوب المستخدمة لتغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا (CFE) داخل حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة (GUV) للتحقيق في تخليق ودمج بروتين غشاء نموذجي في طبقة الدهون المزدوجة.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

يتناول بروتوكولنا إعادة تكوين بروتين غشائي داخل الطبقة الدهنية المزدوجة لخلية اصطناعية مصنوعة باستخدام طريقة مستحلب القطيرات المقلوبة. تتمثل ميزة استخدام طريقة مستحلب القطيرات المقلوبة في قدرتها على توليد خلايا اصطناعية توفر بيئة مستقرة للتعبير الخالي من الخلايا عن بروتينات الغشاء. يقدم بروتوكولنا طريقة قوية للباحثين في هذا المجال لتجميع بروتينات الغشاء داخل الخلايا الاصطناعية باستخدام نظام التعبير الخالي من الخلايا.يعمل مختبري على إعادة تكوين قنوات أيونية مختلفة في الخلايا الاصطناعية من خلال إعادة تكوين جهد الفعل بواسطة مجموعة محددة جيدا من القنوات الأيونية.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

790 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. يتناول بروتوكولنا إعادة تكوين بروتين غشائي داخل الطبقة الدهنية المزدوجة لخلية اصطناعية مصنوعة باستخدام طريقة مستحلب القطيرات المقلوبة. تتمثل ميزة استخدام طريقة مستحلب القطيرات المقلوبة في قدرتها على توليد خلايا اصطناعية توفر بيئة مستقرة للتعبير الخالي من الخلايا عن بر?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إعادة تكوين البروتين الغشائي في الخلايا الاصطناعية

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

تفاعلات التعبير الخالية من الخلايا السائبة مع الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة (SUVs) لتطبيقات الخلايا الاصطناعية

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.