APLは、全米科学財団(EF1935265)、国立衛生研究所(R01-EB030031およびR21-AR080363)、および陸軍研究局(80523-BB)からの支援を認めています

この研究に使用した試薬と機器は、 資料表に記載されています。
1. 小さな単層小胞(SUV)の存在下でのバルクCFE反応
<ol><li>SUVの準備 注:この手順は、クロロホルムの使用に関する安全指示に従って、ドラフト内で実行する必要があります。<ol><li>ガラスバイアルに5 mM 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)SUVを調製するには、クロロホルムに溶解した25 mg/mL POPCストック溶液76 μLを移します。</li>
		<li>ガラスバイアルを静かに回転させながら、アルゴンをバイアルに穏やかに吹き込み、底に乾燥脂質の膜を形成します。次に、ガラスバイアルをデシケーターに移し、キャップを緩くねじ込んで余分なクロロホルムを蒸発させます。</li>
		<li>ガラスバイアルをデシケーターに1時間保管します。その後、0.5mLの超純脱イオン水を加えて脂質膜を溶解し、約2分間ボルテックスします。</li>
		<li>2つのフィルターサポートを脱イオン水に浸し、それらを各内膜サポートに配置することにより、ミニ押出装置をセットアップします。次に、100 nmのポリカーボネートフィルターを浸し、エクストルーダーのアウターケーシングとリテーナーナットで一緒に保持されている2つの内部メンブレンサポートの間に置きます。このセットアップをエクストルーダースタンドに置きます。</li>
		<li>2つの1 mL気密シリンジを超高純度脱イオン水で3回洗い流します。</li>
		<li>脂質と水の混合物のサンプルを1 mLの気密シリンジの1つにロードし、スイングアームクリップを使用してシリンジを所定の位置に保持するミニエクストルーダーの一方の端に置きます。2番目のシリンジをミニエクストルーダーのもう一方の端に挿入し、完全に押し下げられていることを確認します。 注意: シリンジに脂質と水の混合物をセットするときは、シリンジをミニ押出機に通す前に、シリンジに空気がないことを確認してください。</li>
		<li>元のシリンジからの脂質と水の混合物をミニ押出機装置を介して空のシリンジに静かに通過させます。.この手順を11回繰り返して、SUVを形成します。SUVを1.5mLの微量遠心チューブに移します。 注:SUV溶液は、4°Cで最大2週間保存できます。</li>
	</ol></li>
	<li>CFE反応アセンブリ<ol><li>CFE反応は、以下で詳述するわずかな変更を加えたメーカーが提供する無細胞発現プロトコルに従って組み立てます。</li>
		<li>溶液1(アミノ酸、NTP、tRNAおよび酵素用基質、および必要な緩衝液を含む)10μL、溶液2(タンパク質20%グリセロール中タンパク質)1μL、溶液3(リボソーム(20μM))2μL、可溶性sfGFP-sfCherry(1-10)27(以下、可溶性sfGFPと呼ぶ)、WT-GluR0-sfGFP、またはPRSP-GluR0-sfGFP(10-60ng/1000塩基対)を10μL混合し、 1 μLマウスRNAse阻害剤、および膜タンパク質用の5 mM SUV溶液4 μLまたは可溶性タンパク質用の4 μLの水。</li>
		<li>超高純度の脱イオン水を加えて、反応の最終容量を20 μLにします。 注意: CFEシステムを組み立てるときは、すべてのコンポーネントを氷の上に置いておく必要があります。すべての材料は温度に敏感であり、室温に達すると劣化する可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>CFE反応のインキュベーションとモニタリング<ol><li>CFE溶液を96ウェル円錐形V底プレートに移します。反応中の蒸発を防ぐために、シーリングフィルムを使用してプレートを覆います。</li>
		<li>プレートリーダーでプレートを37°Cで4〜5時間インキュベートし、CFE反応をモニタリングしながら、488 nm/528 nmの励起/発光波長で2分ごとに100のゲインでGFPシグナルを測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. GUVに封入されたCFE反応
<ol><li>GUVアウターバッファー溶液の調製<ol><li>1.5 mLの微量遠心チューブに、1 Mスペルミジン1.5 μL、100 mM ATP37.5 μL、100 mM GTP25 μL、100 mM CTP12.5 μL、100 mM CTP12.5 μL、100 mM UTP25 μL、1 Mクレアチンリン酸25 μL、1 M酢酸マグネシウム18 μL、3 Mグルタミン酸カリウム93.33 μLを混合します。 50 μL の 1 M HEPES KOH (pH 7.4)、1.15 μL の 332 mM フォリン酸、100 μL の 2 M グルコース、および 50 μL の 20 アミノ酸のそれぞれの 6 mM 混合物のストック溶液 (Sun et al.28 に記載されているプロトコルに従って調製)。</li>
		<li>超精製脱イオン水を加えて、溶液の最終容量を1 mLにします。 注意: すべてのコンポーネントは氷上に保管する必要があります。アミノ酸の枯渇を避けるために、最後にアミノ酸混合物を追加します28。溶液は330μLのアリコートに分注し、使用するまで-20°Cで保存できます。</li>
	</ol></li>
	<li>油中脂質混合物の調製 注:この手順は、クロロホルムの使用に関する安全指示に従って、ドラフト内で実行する必要があります。<ol><li>ドラフト内で、17.3 μLの25 mg/mL POPCストック溶液と1.08 μLの50 mg/mLポリ(ブタジエン)-b-ポリ(エチレンオキシド)(PEO-b-PBD)共重合体を15 mLガラスバイアルに混合します。 注:最終的な油中脂質溶液には、0.5 mMの脂質と95%および5%のPOPCおよびPEO-b-PBDが含まれています。PEO-b-PBDは、タンパク質発現中の膜安定性を高めるために使用されましたが、脂質分子29,30から分離したミセルに凝集するコポリマーの傾向を減らすために、低分子比に保たれました。</li>
		<li>ガラスバイアルにアルゴンガスをゆっくりと吹き込み、バイアルを回転させてクロロホルムを蒸発させます。</li>
		<li>乾燥脂質が入った15mLのガラスバイアルに1.2mLの軽質鉱物油をピペットで入れます。</li>
		<li>脂質と油を最高速度で10〜20秒間ボルテックスして混合します。溶解した脂質-共重合体混合物は白濁して見えます。</li>
		<li>オイル中の脂質凝集体がすべて完全に溶解し、オイル全体に分散するようにするには、ガラスバイアルを約50°Cのオーブンに20分間入れてから、最大速度でさらに10〜20秒間ボルテックスします。</li>
	</ol></li>
	<li>CFE反応の組み立てとカプセル化(図1 は以下のステップをまとめたものです)。<ol><li>ステップ 2.1 で調製した CFE 外部緩衝液 270 μL、5 M NaCl 15 μL、4.5 M KCl 15 μL を混合して、1.5 mL の微量遠心チューブに 300 μL の GUV 外部溶液を調製します。 注:このステップでは、0.45 μLの1 M 1,4-ジチオスレイトール(DTT)をGUV外部溶液に加えます。NaClとKClを添加する目的は、外側の溶液の浸透圧を内側のCFE溶液と一致するように調整することです。NaClとKClの正確な量は、所望の浸透圧調整に依存します。NaClまたはKClのいずれか、あるいは両方を追加して浸透圧を調整できます。</li>
		<li>300 μLの脂質中油混合物をGUV外部溶液の上に静かにピペットで移します。 注:脂質と油の混合物を添加するときは、油が水溶液と混ざらないことが重要です。添加後、脂質中油混合物とGUV外部溶液との間には目に見える界面があるはずです。</li>
		<li>油-水界面を室温で2時間インキュベートし、脂質単層が界面で形成および安定化するのを待ちます。</li>
		<li>その間、セクション1.2.1に従って、膜タンパク質バリアントまたは可溶性GFPをコードするプラスミドDNAを含むCFE反応を組み立てます。4 μL の 5 mM SUV 溶液または水を 4 μL の 1 M スクロースと交換します。この反応がGUV内部溶液になります。 注:浸透圧計を使用して、内部溶液と外部溶液の浸透圧を測定しました。次に、外側の溶液の浸透圧は、NaClまたは水の添加によってそれに応じて調整されました。CFE反応の浸透圧は通常約1600 mOsm/Kgで、反応にスクロースを添加すると内部溶液密度が増加し、遠心分離ステップ中に小胞が油水界面を横切って移動できるようになります。スクロースの代替品は、Opti-Prep密度グラジエントソリューションです。</li>
		<li>CFE反応液を収めた微量遠心チューブに600μLの脂質-油混合物を加え、~1分間激しく上下にピペットで動かして、油中脂質溶液中で反応液を乳化させ、合成細胞の周囲に脂質単層を形成します。 注:最終的な溶液には気泡がなく、不透明に見える必要があります。</li>
		<li>油水界面が設定された1.5mL微量遠心チューブの油層の上に、内液エマルジョンを静かにピペットで移します。 メモ: インターフェースを邪魔したり、不安定にしたりしないように注意してください。</li>
		<li>2,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 注:遠心分離速度は、このプロトコル用に最適化されています。Adir et al.31 は、異なる遠心分離速度を報告しました。</li>
		<li>遠心分離が終了したら、ピペッターを使用して、余分な油と外部溶液をマイクロ遠心チューブから慎重に取り除きます。残りの容量が約100μLになるまで、外部溶液を取り出します。 注:GUVのペレットは通常、微量遠心チューブの底に見えます。しかし、目に見えるペレットがないからといって、必ずしもGUVの収量がないわけではありません。ピペッターを使用する代わりに、外側の溶液の上にある余分な油分を吸引して取り除くことができます。油中脂質溶液が完全に除去されていることを確認することが重要です。GUV溶液中の油分汚染は、低品質の画像を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>ピペッティングで静かに上下させて、残りの100 μL溶液にGUVペレットを再懸濁します。次に、GUV溶液をきれいな96ウェルクリアフラットボトムプレートに移してインキュベートします。</li>
	</ol></li>
</ol>3. カプセル化されたCFE反応のインキュベーションとイメージング
<ol><li>プレートをシールフィルムで覆い、蒸発を防ぎます。プレートを37°Cで5〜6時間インキュベートします。プレートリーダーを使用し、ステップ1.3.2に従って、インキュベーションステップ用のプレートリーダーを準備できます。</li>
	<li>インキュベーションが終了したら、EMCCDカメラ(またはsCMOSカメラ)、DAQ-MX制御レーザー(または統合レーザーコンバイナーシステム)、およびCSU-X1スピニングディスク共焦点(またはレーザー走査型共焦点)を備えた倒立顕微鏡のイメージングステージに96ウェルプレートを置きます。GUVを含むROIに注目し、Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA対物レンズを使用して488 nmの励起波長で画像を撮影します。</li>
	<li>GUVの画像を.tiff形式で保存します。</li>
	<li>画像処理ソフトウェア(ImageJやFijiなど)で画像を開きます。 明るさ/コントラスト 設定パネルを開きます。蛍光タンパク質が見えるように、明るさとコントラストを適切な設定に調整します。</li>
	<li>発現した異なるタンパク質のシグナル強度を比較することが目的である場合は、まず、Image > Stacksサブメニューの下にあるImages to Stackパネルを使用して、異なるタンパク質を含むGUVの個々の画像をスタックします。次に、明るさ/コントラストパネルを使用して、すべての画像の明るさとコントラストを調整します。</li>
</ol>

巨大単層小胞における膜タンパク質の無細胞発現

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells:+Forging+one+from+many.">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li><li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis.">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Past,+present+and+future.">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells.">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).</li><li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions.">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture.">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes.">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236 (2021).</li><li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis.">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).</li><li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities.">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells.">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles.">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems.">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li><li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li><li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis.">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li><li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems:+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes.">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li><li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems.">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917 (2019).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly.">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).</li><li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins.">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li><li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor.">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells.">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy.">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104 (2023).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

著者は、利益相反を宣言しません。

細胞シグナル伝達や細胞の興奮など、細胞膜を介した分子や情報の伝達に依存するほぼすべての細胞プロセスには、膜タンパク質が必要です。このように、膜タンパク質の再構成は、さまざまなアプリケーション向けのさまざまな合成細胞設計を実現する際の主要なボトルネックとなっています。従来の界面活性剤による生体膜中の膜タンパク質の再構成には、緩やかな膨潤や電気形成など?...

ボトムアップ合成生物学は、バイオエンジニアリング、ドラッグデリバリー、再生医療など、数多くの応用が期待できる新興分野として、過去10年間で関心が高まっています1,2。特に、ボトムアップ合成生物学の礎石としての合成細胞の開発は、合成細胞の有望な応用と、in vitro生物物理学的研究を容易にするその細胞様の物理的および生化学的特性により、幅広い科学コミュニティを引き付けています3,4,5,6 .合成細胞は、多くの場合、細胞サイズの巨大単層小胞(GUV)で操作され、そこでさまざまな生物学的プロセスが再現されます。細胞細胞骨格の再構成7,8、光依存性エネルギー再生9、細胞コミュニケーション10,11、およびバイオセンシング12は、合成細胞における細胞様挙動を再構築するためになされた努力の例である。
一部の細胞プロセスは可溶性タンパク質に依存していますが、センシングやコミュニケーションなどの天然細胞の多くの特性は、イオンチャネル、受容体、トランスポーターなどの膜タンパク質を利用することがよくあります。合成細胞の発生における大きな課題は、膜タンパク質の再構成です。脂質二重層における膜タンパク質再構成の従来の方法は、界面活性剤を介した精製に依存していますが、このような方法は手間がかかり、発現宿主に毒性のあるタンパク質には効果がなく、GUVの膜タンパク質再構成には適していないことがよくあります13。
タンパク質発現の代替方法は、無細胞発現(CFE)システムです。CFEシステムは、細胞溶解物または精製転写翻訳装置14を用いて、さまざまなタンパク質のin vitro発現を可能にする合成生物学における強力なツールである。CFEシステムは、GUVにカプセル化することもでき、したがって、光収集合成細胞9または機械感受性バイオセンサー15,16の作成など、さまざまなアプリケーション向けにプログラム可能な区画化されたタンパク質合成反応を可能にする。組換えタンパク質発現法と同様に、CFEシステムでは膜タンパク質発現が困難です17。CFEシステムにおける凝集、ミスフォールディング、翻訳後修飾の欠如は、CFEシステムを用いた膜タンパク質合成の成功を妨げる主要なボトルネックです。CFEシステムを用いたボトムアップ膜タンパク質再構成の難しさは、シグナルペプチド、シグナル認識粒子、トランスロコン、シャペロン分子に依存する複雑な膜タンパク質生合成経路が存在しないことが一因です。しかし、最近では、翻訳中にミクロソームやリポソームなどの膜構造が存在すると、膜タンパク質の発現が成功することが複数の研究で示唆されています18,19,20,21。さらに、EaglesfieldらおよびSteinküherらは、シグナルペプチドとして知られる特定の疎水性ドメインを膜タンパク質のN末端に含めることで、その発現を有意に改善できることを発見した22,23。全体として、これらの研究は、合成細胞における膜タンパク質の再構成の課題は、タンパク質の翻訳がGUV膜の存在下で行われ、適切なN末端シグナルペプチドが利用されれば克服できることを示唆しています。
ここでは、GUVにおける膜タンパク質再構成のための組換え要素(PURE)CFE反応を用いたタンパク質合成のカプセル化のためのプロトコールを紹介します。モデル膜タンパク質として細菌のグルタミン酸受容体24 (GluR0)を選択し、そのN末端シグナルペプチドが膜再構成に及ぼす影響について研究しています。Eaglesfieldらによって膜タンパク質再構成効率を改善することが示されたプロテオロドプシンシグナルペプチドの効果について、PRSP-GluR0と表記されるGluR0の変異変異体を構築することで検討し、その天然シグナルペプチドを保有する野生型GluR0(以下、WT-GluR0)との発現と膜局在を比較する。このプロトコルは、逆エマルジョン法25 に基づいており、CFEカプセル化に対して堅牢になるように修正されている。提示された方法では、CFE反応は、最初に油中脂質溶液を使用して乳化され、CFEシステムを含み、脂質単分子膜によって安定化されるミクロンサイズの液滴が生成されます。次に、エマルジョン液滴は、別の脂質単層で飽和した油水界面の上に層状になります。次に、エマルジョン液滴は遠心力を介して油水界面を横切って移動するように強制されます。このプロセスを通じて、液滴は別の単層を獲得し、二重層脂質小胞を生成します。次に、CFE反応を含むGUVをインキュベートし、その間に膜タンパク質を発現させてGUV膜に取り込む。このプロトコルは、GluR0の無細胞発現のために指定されているが、他の膜タンパク質の無細胞合成や、細胞骨格再構成や膜融合研究26などの異なる合成細胞応用に用いることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

無細胞発現(CFE)システムは、合成生物学における強力なツールであり、合成細胞におけるバイオセンシングやエネルギー再生などの細胞機能のバイオミミクリーを可能にします。しかし、広範囲の細胞プロセスを再構築するには、膜タンパク質を合成細胞の膜にうまく再構成する必要があります。可溶性タンパク質の発現は通常、一般的なCFEシステムで成功しますが、合成細胞の脂質二重層における膜タンパク質の再構成は困難であることが証明されています。本研究では、モデル膜タンパク質である細菌のグルタミン酸受容体(GluR0)を巨大単層小胞(GUV)に再構成する方法を、合成細胞内でCFE反応をカプセル化し、インキュベーションすることに基づいて、モデル合成細胞として紹介します。このプラットフォームを利用して、GluR0のN末端シグナルペプチドをプロテオロドプシンシグナルペプチドに置き換えることで、GluR0のハイブリッドGUVの膜への共翻訳転座の成功に対する効果が実証されます。この方法は、合成細胞中のさまざまな膜タンパク質を無細胞で再構成することを可能にする堅牢な手順を提供します。

CFE反応をカプセル化する前に、未変性シグナルペプチドとプロテオロドプシンシグナルペプチド(シグナルペプチド配列は 補足表1に示されています)を持つGluR0-sfGFPの2つのバリアントと可溶性sfGFPをバルク反応で個別に発現させ、プレートリーダーを使用してsfGFPシグナルを検出することによりそれらの発現をモニターしました(図2A)。).膜タンパ?...

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著者スポットライト:合成細胞における膜タンパク質の再構成

このプロトコルは、脂質二重層へのモデル膜タンパク質の合成および取り込みの研究のために、巨大単層小胞(GUV)内に無細胞発現(CFE)システムをカプセル化するために使用される逆エマルジョン法を説明しています。

無細胞発現系のカプセル化による細菌グルタミン酸受容体チャネルの再構成

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

私たちのプロトコルは、逆液滴エマルジョン法を使用して作られた合成細胞の脂質二重層内の膜タンパク質の再構成に対処します。逆液滴エマルジョン法の利点は、膜タンパク質を無細胞で発現するための安定した環境を提供する合成細胞を作製できることです。私たちのプロトコールは、この分野の研究者が無細胞発現システムを使用して合成細胞内の膜タンパク質を合成するための堅牢な方法を提供します。私の研究室では、明確に定義されたイオンチャネルのセットによる活動電位の再構成を通じて、合成細胞のさまざまなイオンチャネルを再構成することに取り組んでいます。

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

1.0K ビュー.  University of Michigan, Ann Arbor. 私たちのプロトコルは、逆液滴エマルジョン法を使用して作られた合成細胞の脂質二重層内の膜タンパク質の再構成に対処します。逆液滴エマルジョン法の利点は、膜タンパク質を無細胞で発現するための安定した環境を提供する合成細胞を作製できることです。私たちのプロトコールは、この分野の研究者が無細胞発現システムを使用して合成細胞内の膜タンパク質?...

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

生物工学

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A general protocol is described for the preparation of V. natriegens crude cell extracts using common laboratory equipment. This high yielding protocol has been specifically optimized for user accessibility and reduced cost. Cell-free protein synthesis (CFPS) can be carried out in small scale 10 &#956;L batch reactions in either a 96- or 384-well format and reproducibly yields concentrations of &#62; 260 &#956;g/mL super folder GFP (sfGFP) within 3 h. Overall, crude cell extract preparation and CFPS can be achieved in 1&#8722;2 full days by a single user. This protocol can be easily integrated into existing protein synthesis pipelines to facilitate advances in bio-production and synthetic biology applications.

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free expression systems are powerful and cost-efficient tools for the high-throughput synthesis and screening of important proteins. Here, we describe the preparation of cell-free protein expression system using Vibrio natriegens for the rapid protein production using plasmid DNA, linear DNA, and mRNA template.

無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

シュードモナスシリンゲpvに対する耐性のハイスループット同定苗フラッドアッセイを用いたトマトのトマト

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic biology. Unfortunately, commercially available systems are costly, and their tunability is limited. In comparison, a home-made approach can be customized based on user needs. However, the preparation of home-made systems is time-consuming and arduous due to the need for ribosomes as well as 36 medium scale protein purifications. Streamlining protein purification by coculturing and co-purification allows for minimizing time and labor requirements. Here, we present an easy, adjustable, time- and cost-effective method to produce all PURE system components within 1 week, using standard laboratory equipment. Moreover, the performance of the OnePot PURE is comparable to commercially available systems. The OnePot PURE preparation method expands the accessibility of the PURE system to more laboratories due to its simplicity and cost-effectiveness.

We present a fast and cost-effective method to produce the recombinant PURE cell-free TX-TL system using standard laboratory equipment.

ワンポット純粋な無細胞システム

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...