APL bedankt sich für die Unterstützung durch die National Science Foundation (EF1935265), die National Institutes of Health (R01-EB030031 und R21-AR080363) und das Army Research Office (80523-BB)

Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Bulk-CFE-Reaktionen in Gegenwart von kleinen unilamellären Vesikeln (SUVs)
<ol><li>SUV-Vorbereitung HINWEIS: Dieser Schritt muss in einem Abzug gemäß den Sicherheitshinweisen für die Arbeit mit Chloroform durchgeführt werden.<ol><li>Bereiten Sie 5 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) SUVs in einem Glasfläschchen vor, indem Sie 76 μl 25 mg/ml POPC-Stammlösung, gelöst in Chloroform, umfüllen.</li>
		<li>Während Sie das Glasfläschchen vorsichtig drehen, blasen Sie einen sanften Argonstrahl in das Fläschchen, um am Boden einen Film aus getrockneten Lipiden zu bilden. Übertragen Sie anschließend das Glasfläschchen in einen Exsikkator, wobei die Kappe locker verschraubt ist, um überschüssiges Chloroform zu verdampfen.</li>
		<li>Bewahren Sie das Glasfläschchen 1 h lang im Exsikkator auf. Fügen Sie dann 0,5 ml ultrareines deionisiertes Wasser hinzu, um den Lipidfilm aufzulösen und etwa 2 Minuten lang zu wirbeln.</li>
		<li>Richten Sie eine Mini-Extrusionsvorrichtung ein, indem Sie zwei Filterträger in entionisiertem Wasser einweichen und auf jeden der internen Membranträger legen. Tränken Sie dann einen 100-nm-Polycarbonatfilter und platzieren Sie ihn zwischen den beiden internen Membranstützen, die durch das Außengehäuse des Extruders und die Haltemutter zusammengehalten werden. Platzieren Sie dieses Setup in den Extruderständer.</li>
		<li>Spülen Sie zwei gasdichte 1-mL-Spritzen 3 Mal mit ultrareinem entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Laden Sie die Probe des Lipid-Wasser-Gemisches in eine der gasdichten 1-ml-Spritzen und platzieren Sie sie mit den Schwenkarmclips an einem Ende des Mini-Extruders, um die Spritze an Ort und Stelle zu halten. Führen Sie die zweite Spritze in das andere Ende des Mini-Extruders ein und stellen Sie sicher, dass sie vollständig eingedrückt ist. HINWEIS: Wenn Sie die Spritze mit dem Lipid-Wasser-Gemisch befüllen, stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Spritze befindet, bevor Sie sie durch den Mini-Extruder leiten.</li>
		<li>Das Lipid-Wasser-Gemisch wird vorsichtig von der Originalspritze in die leere Spritze durch den Mini-Extruder geleitet. Wiederhole diesen Schritt 11 Mal, um SUVs zu formen. Übertragen Sie die SUVs in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die SUV-Lösung kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>CFE-Reaktionsanordnung<ol><li>Assemblieren Sie die CFE-Reaktion gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten zellfreien Expressionsprotokoll mit geringfügigen Änderungen, die im Folgenden beschrieben werden.</li>
		<li>Mischen Sie 10 μl Lösung 1 (enthält Aminosäuren, NTPs, tRNAs und Substrate für Enzyme sowie den erforderlichen Puffer), 1 μl Lösung 2 (Proteine in 20 % Glycerin), 2 μl Lösung 3 (Ribosom (20 μM)), eine geeignete Menge der DNA, die für lösliches sfGFP-sfCherry(1-10)27 (im Folgenden als lösliches sfGFP bezeichnet), WT-GluR0-sfGFP oder PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 Basenpaare) kodiert, 1 μl muriner RNAse-Inhibitor und 4 μl 5 mM SUV-Lösung für Membranproteine oder 4 μl Wasser für lösliche Proteine.</li>
		<li>Bringen Sie das Endvolumen der Reaktion auf 20 μl, indem Sie ultrareines entionisiertes Wasser hinzufügen. HINWEIS: Bei der Montage des CFE-Systems müssen alle Komponenten auf Eis gehalten werden. Alle Materialien sind temperaturempfindlich und können sich zersetzen, wenn sie Raumtemperatur erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation und Überwachung der CFE-Reaktion<ol><li>Übertragen Sie die CFE-Lösung auf eine konische 96-Well-Platte mit V-Boden. Um eine Verdunstung während der Reaktion zu verhindern, decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem Plattenlesegerät für 4-5 Stunden und überwachen Sie dabei die CFE-Reaktion, indem Sie das GFP-Signal mit einer Verstärkung von 100 bei 488 nm/528 nm Anregungs-/Emissionswellenlängen alle 2 Minuten messen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In GUVs eingekapselte CFE-Reaktionen
<ol><li>Herstellung der äußeren GUV-Pufferlösung<ol><li>Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 μl 1 M Spermidin, 37,5 μl 100 mM ATP, 25 μl 100 mM GTP, 12,5 μl 100 mM CTP, 12,5 μl 100 mM UTP, 25 μl 1 M Kreatinphosphat, 18 μl 1 M Magnesiumacetat, 93,33 μl 3 M Kaliumglutamat, 50 μl 1 M HEPES KOH (PH 7,4), 1,15 μl 332 mM Folinsäure, 100 μl 2 M Glukose und 50 μl aus Stammlösung von 6 mM Mischung jeder der 20 Aminosäuren (hergestellt nach dem von Sun et al.28 beschriebenen Protokoll).</li>
		<li>Bringen Sie das endgültige Volumen der Lösung auf 1 ml, indem Sie hochreines deionisiertes Wasser hinzufügen. HINWEIS: Alle Komponenten müssen auf Eis aufbewahrt werden. Fügen Sie die Aminosäuremischung am Ende hinzu, um einen Aminosäuremangelzu vermeiden 28. Die Lösung kann in 330 μl Aliquoten aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Zubereitung des Lipid-in-Öl-Gemisches HINWEIS: Dieser Schritt muss in einem Abzug gemäß den Sicherheitshinweisen für die Arbeit mit Chloroform durchgeführt werden.<ol><li>Mischen Sie in einem Abzug 17,3 μl 25 mg/ml POPC-Stammlösung und 1,08 μl 50 mg/ml Poly(butadien)-b-poly(ethylenoxid) (PEO-b-PBD)-Copolymer in einem 15-ml-Glasfläschchen. HINWEIS: Die endgültige Lipid-in-Öl-Lösung enthält 0,5 mM Lipid mit 95 % bzw. 5 % POPC bzw. PEO-b-PBD. PEO-b-PBD wurde verwendet, um die Membranstabilität während der Proteinexpression zu verbessern, wurde jedoch in einem niedrigen molaren Verhältnis gehalten, um die Tendenz des Copolymers zu reduzieren, zu Mizellen zu aggregieren, die von den Lipidmolekülen getrennt sind29,30.</li>
		<li>Blasen Sie vorsichtig einen sanften Strahl Argongas in das Glasfläschchen, während Sie das Fläschchen drehen, um das Chloroform zu verdampfen.</li>
		<li>Pipettieren Sie 1,2 mL helles Mineralöl in das 15 mL Glasfläschchen mit den getrockneten Lipiden.</li>
		<li>Mischen Sie die Lipide und das Öl, indem Sie sie 10-20 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Das gelöste Lipid-Copolymer-Gemisch sieht trüb aus.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass alle möglichen Lipidaggregate im Öl vollständig aufgelöst und im Öl verteilt sind, stellen Sie das Glasfläschchen 20 Minuten lang bei ca. 50 °C in einen Ofen, bevor Sie es weitere 10-20 s bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblierung und Verkapselung der CFE-Reaktion (Abbildung 1 fasst die folgenden Schritte zusammen).<ol><li>Bereiten Sie 300 μl der GUV-Außenlösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 270 μl der in Schritt 2.1 hergestellten CFE-Außenpufferlösung, 15 μl 5 M NaCl und 15 μl 4,5 M KCl mischen. HINWEIS: In diesem Schritt werden 0,45 μl 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) in die äußere GUV-Lösung gegeben. Der Zweck der Zugabe von NaCl und KCl besteht darin, die Osmolalität der äußeren Lösung so anzupassen, dass sie mit der inneren CFE-Lösung übereinstimmt. Das genaue Volumen von NaCl und KCl hängt von der gewünschten Osmolalitätseinstellung ab. Man kann entweder NaCl oder KCl oder beides hinzufügen, um die Osmolalität einzustellen.</li>
		<li>Pipettieren Sie vorsichtig 300 μl des Lipid-in-Öl-Gemisches auf die äußere GUV-Lösung. HINWEIS: Bei der Zugabe der Lipid-Öl-Mischung ist es wichtig, dass sich das Öl nicht mit der wässrigen äußeren Lösung vermischt. Nach der Zugabe sollte eine sichtbare Grenzfläche zwischen dem Lipid-in-Öl-Gemisch und der GUV-Außenlösung vorhanden sein.</li>
		<li>Die Öl-Wasser-Grenzfläche wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, damit sich die Lipid-Monoschicht an der Grenzfläche bilden und stabilisieren kann.</li>
		<li>In der Zwischenzeit ist Abschnitt 1.2.1 zu befolgen, um eine CFE-Reaktion zu assemblieren, die die Plasmid-DNA enthält, die für die Membranproteinvarianten oder lösliches GFP kodiert. Ersetzen Sie die 4 μl 5 mM SUV-Lösung oder Wasser durch 4 μl 1 M Saccharose. Diese Reaktion wird die innere Lösung des GUV sein. HINWEIS: Zur Messung der Osmolalität der inneren und äußeren Lösungen wurde ein Osmometer verwendet. Die Osmolalität der äußeren Lösung wurde dann durch Zugabe von NaCl oder Wasser entsprechend eingestellt. Die Osmolalität der CFE-Reaktion liegt typischerweise bei etwa 1600 mOsm/kg. Die Zugabe von Saccharose zur Reaktion erhöht die innere Lösungsdichte, so dass die Vesikel während des Zentrifugationsschritts über die Öl-Wasser-Grenzfläche wandern können. Eine Alternative zu Saccharose ist die Opti-Prep Dichtegradientenlösung.</li>
		<li>Geben Sie 600 μl Lipid-Öl-Gemisch in das Mikrozentrifugenröhrchen, das die CFE-Reaktion enthält, und pipettieren Sie ~1 Minute lang kräftig auf und ab, um die Reaktion in der Lipid-in-Öl-Lösung zu emulgieren und die Lipid-Monoschicht um die synthetischen Zellen zu bilden. HINWEIS: Die endgültige Lösung sollte keine Blasen aufweisen und undurchsichtig aussehen.</li>
		<li>Pipettieren Sie die innere Lösungsemulsion vorsichtig auf die Ölschicht in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Öl-Wasser-Grenzfläche eingerichtet wurde. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Benutzeroberfläche nicht zu stören oder zu destabilisieren.</li>
		<li>10 min bei 2.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. HINWEIS: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit wurde für dieses Protokoll optimiert. Adir et al.31 berichteten über eine andere Zentrifugationsgeschwindigkeit.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Beendigung der Zentrifugation vorsichtig das überschüssige Öl und die äußere Lösung mit einer Pipette aus dem Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die äußere Lösung, bis das verbleibende Volumen etwa 100 μl beträgt. HINWEIS: Ein Pellet aus GUVs ist normalerweise am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens sichtbar. Das Fehlen eines sichtbaren Pellets bedeutet jedoch nicht zwangsläufig, dass keine GUV-Ausbeute erzielt wird. Anstatt eine Pipette zu verwenden, kann das überschüssige Öl auf der äußeren Lösung durch Aspiration entfernt werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Lipid-in-Öl-Lösung vollständig entfernt wird. Ölverunreinigungen in der GUV-Lösung können zu Bildern mit geringer Qualität führen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das GUV-Pellet in der restlichen 100-μl-Lösung, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie anschließend die GUV-Lösung zur Inkubation auf eine saubere 96-Well-Platte mit klarem flachem Boden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Inkubation und Bildgebung von verkapselten CFE-Reaktionen
<ol><li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5-6 h. Man kann einen Plattenleser verwenden und Schritt 1.3.2 befolgen, um den Plattenleser für den Inkubationsschritt vorzubereiten.</li>
	<li>Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, stellen Sie die 96-Well-Platte auf den Bildgebungstisch eines inversen Mikroskops, das mit einer EMCCD-Kamera (oder einer sCMOS-Kamera), einem DAQ-MX-gesteuerten Laser (oder einem integrierten Laserkombiniersystem) und einer konfokalen CSU-X1-Spinning-Disk (oder einem konfokalen Laserscanning) ausgestattet ist. Fokussieren Sie sich auf beliebige ROI-Aufnahmen mit GUVs und nehmen Sie Bilder bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm mit einem Plan-Apochromat 60 x/1,4 NA-Objektiv auf.</li>
	<li>Speichern Sie Bilder von GUVs in .tiff Format.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilder in einer Bildbearbeitungssoftware (z.B. ImageJ oder Fiji). Öffnen Sie das Einstellungsfeld für Helligkeit/Kontrast . Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an die entsprechenden Einstellungen an, um fluoreszierende Proteine sichtbar zu machen.</li>
	<li>Wenn das Ziel darin besteht, die Signalintensität verschiedener exprimierter Proteine zu vergleichen, stapeln Sie zunächst einzelne Bilder von GUVs, die unterschiedliche Proteine enthalten, mithilfe des Bedienfelds "Bilder zum Stapeln ", das sich im Untermenü "Bild > Stapel" befindet. Passen Sie dann die Helligkeit und den Kontrast aller Bilder mit dem Bedienfeld Helligkeit/Kontrast an.</li>
</ol>

Zellfreie Expression von Membranproteinen in riesigen unilamellären Vesikeln

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Praktisch jeder zelluläre Prozess, der von der Übertragung von Molekülen oder Informationen über die Zellmembran abhängt, wie z. B. die Zellsignalisierung oder die Zellanregung, erfordert Membranproteine. Daher ist die Rekonstitution von Membranproteinen zum Hauptengpass bei der Realisierung verschiedener synthetischer Zelldesigns für unterschiedliche Anwendungen geworden. Die traditionelle Detergenzien-vermittelte Rekonstitution von Membranproteinen in biologischen Membranen erfordert GUV-Erzeugungsmethoden wie sa...

Die synthetische Bottom-up-Biologie hat in den letzten zehn Jahren als aufstrebendes Gebiet mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, der Wirkstoffverabreichung und der regenerativen Medizin zunehmend an Interesse gewonnen 1,2. Insbesondere die Entwicklung synthetischer Zellen als Eckpfeiler der synthetischen Bottom-up-Biologie hat aufgrund der vielversprechenden Anwendungen synthetischer Zellen sowie ihrer zellähnlichen physikalischen und biochemischen Eigenschaften, die biophysikalische In-vitro-Studien erleichtern, ein breites Spektrum an wissenschaftlichen Gemeinschaften angezogen 3,4,5,6 . Synthetische Zellen werden oft in zellgroßen riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) hergestellt, in denen verschiedene biologische Prozesse nachgebildet werden. Die Rekonstitution des Zellzytoskeletts 7,8, die lichtabhängige Energieregeneration9, die zelluläre Kommunikation10,11 und die Biosensorik12 sind Beispiele für Bemühungen, zellähnliche Verhaltensweisen in synthetischen Zellen zu rekonstruieren.
Während einige zelluläre Prozesse auf löslichen Proteinen beruhen, verwenden viele Eigenschaften natürlicher Zellen, wie z. B. Sensorik und Kommunikation, häufig Membranproteine, einschließlich Ionenkanäle, Rezeptoren und Transporter. Eine große Herausforderung in der synthetischen Zellentwicklung ist die Rekonstitution von Membranproteinen. Obwohl traditionelle Methoden der Membranproteinrekonstitution in Lipiddoppelschichten auf einer Detergenz-vermittelten Reinigung beruhen, sind solche Methoden mühsam, unwirksam für Proteine, die für den Expressionswirt toxisch sind, oder oft nicht für die Membranproteinrekonstitution in GUVsgeeignet 13.
Eine alternative Methode zur Proteinexpression sind zellfreie Expressionssysteme (CFE). CFE-Systeme sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der synthetischen Biologie, das die In-vitro-Expression verschiedener Proteine entweder mit Zelllysat oder gereinigter Transkriptions-Translations-Maschinerie ermöglicht14. CFE-Systeme können auch in GUVs verkapselt werden, was kompartimentierte Proteinsynthesereaktionen ermöglicht, die für verschiedene Anwendungen programmiert werden können, wie z. B. die Erzeugung von lichtsammelnden synthetischen Zellen9 oder mechanosensitiven Biosensoren15,16. Analog zu rekombinanten Proteinexpressionsmethoden stellt die Expression von Membranproteinen in CFE-Systemen eine Herausforderungdar 17. Aggregation, Fehlfaltung und fehlende posttranslationale Modifikation in CFE-Systemen sind große Engpässe, die eine erfolgreiche Membranproteinsynthese mit CFE-Systemen behindern. Die Schwierigkeit der Rekonstitution von Bottom-up-Membranproteinen mit Hilfe von CFE-Systemen ist zum Teil auf das Fehlen eines komplexen Biogenesewegs für Membranproteine zurückzuführen, der auf Signalpeptiden, Signalerkennungspartikeln, Translokons und Chaperoning-Molekülen beruht. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Studien darauf hingewiesen, dass das Vorhandensein von membranösen Strukturen wie Mikrosomen oder Liposomen während der Translation eine erfolgreiche Expression von Membranproteinen fördert 18,19,20,21. Darüber hinaus haben Eaglesfield et al. und Steinküher et al. herausgefunden, dass der Einschluss spezifischer hydrophober Domänen, die als Signalpeptide bekannt sind, in den N-Terminus des Membranproteins dessen Expression signifikant verbessern kann 22,23. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass die Herausforderung der Rekonstitution von Membranproteinen in synthetischen Zellen überwunden werden kann, wenn die Proteintranslation in Gegenwart der GUV-Membran erfolgt und wenn das richtige N-terminale Signalpeptid verwendet wird.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Verkapselung der Proteinsynthese unter Verwendung von rekombinanten Elementen (PURE) CFE-Reaktionen zur Rekonstitution von Membranproteinen in GUVs vorgestellt. Der bakterielle Glutamatrezeptor24 (GluR0) wird als Modellmembranprotein ausgewählt und die Wirkung seines N-terminalen Signalpeptids auf seine Membranrekonstitution untersucht. Die Wirkung des Proteorhodopsin-Signalpeptids, das von Eaglesfield et al.22 gezeigt wurde, dass es die Rekonstitutionseffizienz von Membranproteinen verbessert, wird untersucht, indem eine mutierte Variante von GluR0 mit der Bezeichnung PRSP-GluR0 konstruiert und seine Expression und Membranlokalisation mit Wildtyp-GluR0 (im Folgenden als WT-GluR0 bezeichnet), das sein natives Signalpeptid beherbergt, verglichen wird. Dieses Protokoll basiert auf dem invertierten Emulsionsverfahren25 mit Modifikationen, die es für die CFE-Verkapselung robust machen. Bei der vorgestellten Methode werden die CFE-Reaktionen zunächst mit einer Lipid-in-Öl-Lösung emulgiert, die mikrometergroße Tröpfchen erzeugt, die das CFE-System enthalten und durch die Lipidmonoschicht stabilisiert werden. Die Emulsionströpfchen werden dann auf eine Öl-Wasser-Grenzfläche geschichtet, die mit einer weiteren Lipid-Monoschicht gesättigt ist. Die Emulsionströpfchen werden dann durch die Zentrifugalkraft gezwungen, über die Öl-Wasser-Grenzfläche zu wandern. Durch diesen Prozess erhalten die Tröpfchen eine weitere Monoschicht, wodurch ein zweischichtiges Lipidvesikel entsteht. Die GUVs, die die CFE-Reaktion enthalten, werden dann inkubiert, wobei das Membranprotein exprimiert und in die GUV-Membran eingebaut wird. Obwohl dieses Protokoll für die zellfreie Expression von GluR0 spezifiziert ist, kann es für die zellfreie Synthese anderer Membranproteine oder verschiedene synthetische Zellanwendungen wie die Rekonstitution des Zytoskeletts oder Membranfusionsstudien verwendet werden26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

Zellfreie Expressionssysteme (CFE) sind leistungsfähige Werkzeuge in der synthetischen Biologie, die die Biomimikry zellulärer Funktionen wie Biosensorik und Energieregeneration in synthetischen Zellen ermöglichen. Die Rekonstruktion einer Vielzahl zellulärer Prozesse erfordert jedoch die erfolgreiche Rekonstitution von Membranproteinen in die Membran synthetischer Zellen. Während die Expression löslicher Proteine in gängigen CFE-Systemen in der Regel erfolgreich ist, hat sich die Rekonstitution von Membranproteinen in Lipiddoppelschichten synthetischer Zellen als schwierig erwiesen. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Rekonstitution eines Modellmembranproteins, des bakteriellen Glutamatrezeptors (GluR0), in riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) als synthetische Modellzellen auf der Grundlage der Verkapselung und Inkubation der CFE-Reaktion in synthetischen Zellen demonstriert. Unter Verwendung dieser Plattform wird der Effekt der Substitution des N-terminalen Signalpeptids von GluR0 durch das Proteorhodopsin-Signalpeptid auf die erfolgreiche cotranslationale Translokation von GluR0 in Membranen von hybriden GUVs demonstriert. Mit dieser Methode steht ein robustes Verfahren zur Verfügung, das die zellfreie Rekonstitution verschiedener Membranproteine in synthetischen Zellen ermöglicht.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Autor im Rampenlicht: Rekonstitution von Membranproteinen in synthetischen Zellen

Rekonstitution des bakteriellen Glutamatrezeptorkanals durch Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems

Vor der Verkapselung der CFE-Reaktionen wurden zwei Varianten von GluR0-sfGFP, die native und Proteorhodopsin-Signalpeptide beherbergen (die Signalpeptidsequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt), und das lösliche sfGFP einzeln in Massenreaktionen exprimiert, und ihre Expression wurde durch Detektion des sfGFP-Signals mit einem Plattenlesegerät überwacht (Abbildung 2A). Membranproteine wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 nm SUVs ...

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Dieses Protokoll beschreibt das invertierte Emulsionsverfahren, das zur Verkapselung eines zellfreien Expressionssystems (CFE) in einem riesigen unilamellären Vesikel (GUV) zur Untersuchung der Synthese und des Einbaus eines Modellmembranproteins in die Lipiddoppelschicht verwendet wird.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Unser Protokoll befasst sich mit der Rekonstitution eines Membranproteins in der Lipiddoppelschicht einer synthetischen Zelle, die mit der Methode der invertierten Tröpfchenemulsion hergestellt wird. Der Vorteil der Anwendung der invertierten Tröpfchenemulsionsmethode besteht in ihrer Fähigkeit, synthetische Zellen zu erzeugen, die eine stabile Umgebung für die zellfreie Expression von Membranproteinen bieten. Unser Protokoll bietet Forschern auf diesem Gebiet eine robuste Methode zur Synthese von Membranproteinen in synthetischen Zellen unter Verwendung eines zellfreien Expressionssystems.Mein Labor arbeitet an der Rekonstitution verschiedener Ionenkanäle in synthetischen Zellen durch die Rekonstitution des Aktionspotentials durch einen genau definierten Satz von Ionenkanälen.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

815 Aufrufe.  University of Michigan, Ann Arbor. Unser Protokoll befasst sich mit der Rekonstitution eines Membranproteins in der Lipiddoppelschicht einer synthetischen Zelle, die mit der Methode der invertierten Tröpfchenemulsion hergestellt wird. Der Vorteil der Anwendung der invertierten Tröpfchenemulsionsmethode besteht in ihrer Fähigkeit, synthetische Zellen zu erzeugen, die eine stabile Umgebung für die zellfreie Expression von Membranproteinen bieten. Unser Protokoll bietet Forschern auf diesem Gebiet eine robuste Methode zur Syn...

Serie: Autor im Rampenlicht: Rekonstitution von Membranproteinen in synthetischen Zellen

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.