Bu çalışma Pittsburgh Cure Sarkom (PCS) ve Osteosarkom Enstitüsü (OSI) tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Pittsburgh Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak onaylanmıştır.
1. Demineralizasyon gerektiren kemik dokusu örneklerinin FFPE bloklarını hazırlama yöntemi
<ol><li>Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması<ol><li>EDTA% 20 pH 8.0 hazırlayın. 1 L için 200 g EDTA'yı 800 mL ultra saf suda çözün, sodyum hidroksit 10 N ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve son olarak hacmi ultra saf su ile 1L'ye getirin. Oda sıcaklığında saklayın. NOT: Her zaman taze hazırlanmış EDTA %20 pH 8.0 kullanın. Sodyum hidroksit (NaOH) 10 N, 400 g NaOH'nin 1 L ultra saf suda çözülmesiyle hazırlanır.</li>
		<li>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1x PBS kullanarak bir çeker ocakta %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. NOT: Konsantre paraformaldehit çözeltileri veya paraformaldehit katıları ile çalışmak için çeker ocakta bir alan belirleyin ve bu şekilde etiketleyin. Maruz kalmayı önlemek için kapları mümkün olduğunca kapalı tutun. Gerçekleştirilen deney için gereken en küçük pratik miktarlarda kullanın. Paraformaldehit tozu tartımı ve tartı bir çeker ocakta kullanılamıyorsa, önce bir kap alın, ardından davlumbaza PFA tozu ekleyin ve tozu tartmak için kantara geri dönmeden önce kapağını kapatın. Her zaman taze hazırlanmış %4 PFA kullanın.</li>
		<li>Her numune için uygun bir kap kullanın. NOT: Örneğin, 1 mg kemik dokusu için, herhangi bir çözeltinin en az 1 mL'sinin kemikle temas etmesine izin veren bir kap kullanın.</li>
		<li>Diseksiyon için gerekli tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin.</li>
		<li>RNazları gidermek için tüm alanları dekontamine edici bir solüsyonla temizleyin.</li>
		<li>Buz kapları, %70 etanol spreyi dahil olmak üzere kalan deneysel materyalleri toplayın ve bir yörünge çalkalayıcıya erişin.</li>
	</ol></li>
	<li>Farelerden kemik dokusu örneklerinin izolasyonu<ol><li>Fareyi CO2 maruziyeti ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın ve sırt üstü yatırın. Fare derisine% 70 etanol püskürtün.</li>
		<li>Steril diseksiyon makası kullanarak cildi açın ve bacak kasını ortaya çıkarın. Kemiğin konumunu net bir şekilde görmek için kası bacakla birlikte kesin ve zarar görmeden çıkarmak için kemiği nazikçe ayırın. NOT: Kemiğe bağlı tüm kasların tamamen çıkarılması gerekli değildir. RNA bozulmasını sınırlamak için mümkün olduğunca hızlı olmaya çalışın.</li>
		<li>Kemik örneğini hemen %4 PFA içeren bir tüpe yerleştirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>İstediğiniz gibi diğer kemik örneklerini toplamak için prosedürü tekrarlayın.</li>
		<li>Uygun fiksasyonu sağlamak için %4 PFA'lı numuneleri en az 24 saat boyunca 4 ° C'de 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kemik dokusu örneklerinin dekalsifikasyonu<ol><li>Fiksasyondan sonra kemik dokusunu orbital çalkalayıcıdan alın.</li>
		<li>Kalan PFA'yı çıkarmak için kemik dokusunu 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 3 dakika boyunca 1x PBS ile 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Steril diseksiyon makası kullanarak, hala kemiğe bağlı kalan kasları çıkarın.</li>
		<li>Kemik dokusunu 1x PBS ile 3 dakika boyunca bir kez daha yıkayın.</li>
		<li>Kemik dokusunu %20 EDTA pH 8.0 olan yeni bir kaba koyun. Ardından, kabı oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Çözeltiyi atın, kabın içine taze% 20 EDTA pH 8.0 ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Adım 1.3.6'yı 10 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Çözeltiyi atın, kabın içine taze %20 EDTA pH 8.0 ekleyin ve gece boyunca 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde soğuk bir odada 4 °C'ye yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kemik dokusu örneklerinin dehidrasyonu<ol><li>Kemik dokusu örneğini kaptan alın.</li>
		<li>Dokuyu inceleyin ve kemiği nazikçe döndürerek ve bükerek dekalsifikasyonun etkinliğini doğrulayın. Alternatif olarak, bir X-ışını makinesi kullanarak kemiğin röntgenini çekin. NOT: Numune kolayca esniyorsa, iyi bir dekalsifikasyon derecesi elde edilmiştir. Değilse, dekalsifikasyon parametreleri (zaman, ajitasyon hızı, kullanılan %20 EDTA pH 8.0. hacmi vb.) arttırılmalıdır.</li>
		<li>EDTA kalıntılarını gidermek için kemik dokusunu 1x PBS ile 3 dakika boyunca 2 kez yıkayın.</li>
		<li>Kemik dokusunu yeni bir kaba koyun ve% 70 etanol ile dehidrasyonu başlatın. 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%70 etanol çözeltisini atın, numuneyi %90 etanol çözeltisine koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%90 etanol çözeltisini atın, numuneyi %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>%100 etanolü atın, numuneyi yeni %100 etanole koyun ve 140 rpm'de 45 dakika inkübe edin. NOT: Dehidrasyon, otomatik bir işlemci kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bu durumda, programı manuel dehidrasyon için bildirilen aynı koşullarla ayarlayın. Bildirilen koşullar, 4 mm'den daha kalın olmayan örnekler içindir (yani, farelerden elde edilen kemik dokusu örnekleri). 4 mm'den daha kalın numuneler için dehidrasyon zamanlaması deneysel olarak belirlenmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kemik dokusu örneklerinin temizlenmesi<ol><li>Kemik dokusu örneğini yeni bir kaba koyun ve ksilen kullanarak temizleme işlemini başlatın. 140 rpm'de 20 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Kullanılmış ksileni atın, yeni ksilen ekleyin ve 140 rpm'de 20 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>Kullanılmış ksileni atın, yeni ksilen ekleyin ve 140 rpm'de 45 dakika inkübe edin. NOT: Temizleme, otomatik bir işlemci kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bu durumda, programı manuel temizleme için bildirilen koşulların aynısıyla ayarlayın. Bildirilen koşullar, 4 mm'den daha kalın olmayan örnekler içindir (yani, farelerden elde edilen kemik dokusu örnekleri). 4 mm'den daha kalın numuneler için zamanlama deneysel olarak belirlenmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kemik dokusu örneklerinin infiltrasyonu ve gömülmesi<ol><li>Temizledikten sonra kemik dokusu örneğini orbital çalkalayıcıdan/otomatik işlemciden alın.</li>
		<li>Kemik dokusu örneğini bir gömme kasete yerleştirin ve balmumu ile sızmayı başlatın (bkz. Malzeme Tablosu). 60 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Kullanılmış balmumu atın, yeni balmumu ekleyin ve 60 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Kullanılmış balmumu atın, yeni balmumu ekleyin ve 60 °C'de 45 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Kemik dokusu örneğini istenen yönde bir kalıba dikkatlice yerleştirin.</li>
		<li>Numune bloğunun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Elde edilen FFPE'yi kesitlemeye başlamaya hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. NOT: FFPE blok, kesitleme yapılmadan önce uzun yıllar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Demineralize edilmemiş FFPE numunelerinin kesitlerine ayrılması için yönergeler
NOT: Aşağıdaki kılavuzlar, özellikle küçük, kireçten arındırılmamış kemik örneklerinde RNA bozulmasını önlerken doku bölümlerinin kalitesini büyük ölçüde iyileştirmek için yararlı olan değerli ipuçları ve talimatlar sağlar. Bu kılavuzlar, mevcut olduğunda kalsifiye edilmiş kemik örneklerine de uygulanabilir. Daha büyük kemik dokusu örnekleri için, daha kaliteli kesitler elde etmek için demineralizasyon yapılmalıdır; Bu gibi durumlarda, yukarıda bildirilen yöntem izlenmeli ve parametreler (zamanlama, çözelti hacimleri vb.) buna göre ayarlanmalıdır. Aşağıdaki yönergeler, FFPE kemik dokuları zaten işlendiğinde (örneğin, doku bankalarından veya diğer laboratuvarlardan toplanan FFPE bloğu) veya toplanan bölümlerin iyi kalitede RNA, yüksek kaliteli doku kesitleri veya her ikisini birden gerektiren herhangi bir analiz türünü gerçekleştirmek için kullanılacağı durumlarda uygundur.
<ol><li>Ekipman hazırlığı<ol><li>RNazları gidermek için tüm çalışma yüzeylerine ve aletlere dekontamine edici solüsyonlar püskürtün.</li>
		<li>Çift damıtılmış su ile bir su banyosu hazırlayın ve sıcaklığı 42 °C'ye ayarlayın.</li>
		<li>Bir mikrotom bıçağı alın, yağ kalıntılarını gidermek için% 70 etanol püskürtün, ardından RNazları çıkarmak için dekontamine edici solüsyonlarla püskürtün.</li>
		<li>Bıçağı mikrotomun üzerine sabitleyin. Boşluk açısının 10° olarak ayarlandığından emin olun. NOT: Kesit almak için her zaman yeni bıçaklar kullanın.</li>
		<li>İki kova buz hazırlayın.</li>
		<li>Cımbız, fırça ve prob alın, RNazları çıkarmak için dekontamine edici solüsyonlarla püskürtün ve iki buz kovasından birine yerleştirin.</li>
		<li>Diğer buz kovasına çift damıtılmış su ekleyerek bir buz banyosu hazırlayın. NOT: FFPE bloğu eklenen suda yüzmemelidir; Bu nedenle, buz kovasına eklenen su miktarı, numunenin yüzmeden ıslanmasına izin verecek kadar yeterli olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Bölümlere ayırma<ol><li>FFPE bloğunu 4 °C'deki depodan alın ve mikrotomun üzerine yerleştirin. Komutu Kırp veya 14 μm kaydırma kalınlığına ayarlayın ve doku açığa çıkana kadar numuneyi kırpmaya başlayın. NOT: FFPE bloğu zaten kesilmişse ve doku zaten açığa çıkmışsa, adım 2.2.1'i atlayın. Bloğun delik ve çatlak içermediğini doğrulayın. Öyleyse, doğrudan adım 2.2.2'ye ilerleyin. Değilse, yüzeyi düzleştirmek ve deliklerden ve çatlaklardan kaçınmak için birkaç bölüm kesin ve ardından adım 2.2.2'ye geçin.</li>
		<li>Numuneyi nemlendirmek için FFPE bloğunu buz banyosuna yerleştirin. Hidrasyon zamanı deneysel olarak belirlenmelidir.<ol><li>2 dakika ile başlayın ve hidrasyon yeterli değilse süreyi artırın. 10 dakikayı aşmayın. Hidrasyon dokuyu genişletecek ve "Venedik panjurları" ve çizgilerin oluşumunu azaltacaktır. Daha uzun hidrasyon süreleri parafin bloğunda çatlaklara ve muhtemelen doku ayrılmasına neden olabilir.</li>
			<li>Numuneyi nemlendirmek için 10 dakika yetersizse, 10 dakikadan uzun olmayan hidrasyon döngüleri gerçekleştirin ve tekrar kesit almayı deneyin.</li>
			<li>Bloğun yüzeyi çatlaklar veya kesikler nedeniyle pürüzsüz ve temiz değilse, numuneyi yeniden gömmeyi düşünün. RNA kalitesi, yeniden gömme işleminden etkilenmeyecektir.</li>
		</ol></li>
		<li>Numuneyi mikrotomun numune kelepçesine koyun, bıçakla hizalayın ve bölümlere ayırmaya başlayın. Kaydırma kalınlığını 5 μm olarak ayarlayın.</li>
		<li>Kesiti toplayın ve soğuk cımbız ve fırça kullanarak 42 °C'deki su banyosuna yerleştirin. NOT: Alternatif olarak, doku bölümlerinin RNA izolasyonu yapılacaksa, bölümleri bir santrifüj tüpünde toplayın ve RNA hazırlığı için üretim özelliklerini takip edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Dokuyu germek ve kalan kırışıklıkları ve kıvrımları ortadan kaldırmak için bölümü su banyosunda inkübe edin. NOT: Her bölüm için su banyosunda yüzme süresi deneysel olarak belirlenmelidir. Doku ayrılması sorunları ortaya çıkarsa kemik bölümlerini fazladan bir dakika bırakmayı düşünün. Uzun yüzer süreler dokuya zarar verebileceğinden, bölümü çok uzun süre yüzer halde bırakmayın.</li>
		<li>Kesiti bir cam slayt üzerine yerleştirin, ardından 42 °C'de 3 saat inkübe edin.</li>
		<li>Düzgün kurutma için cam sürgüyü gece boyunca RT'de bir kurutucuya veya fırına yerleştirin.</li>
		<li>Cam slaytı, ekli bölümü RT'de olacak şekilde bir slayt kutusunda saklayın. NOT: Slaytlar RT'de uzun yıllar saklanabilir. Uzamsal transkriptomik yapılacaksa, cam bir slayt yerine, bölümü üretici tarafından sağlanan uzamsal gen ekspresyon slaydına yerleştirin ve bildirilen önerileri izleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
</ol>

Demineralize FFPE Kemik Dokusu Örneklerinin RNA Bütünlüğü ile Hazırlanması Protokolü 

<ol>
	<li>Baig, M. A., Bacha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology. Bone. , (2024).</li><li>Currey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+variation+in+the+mineral+content+of+bone.">The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone.</a> J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).</li><li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Undecalcified+bone+preparation+for+histology,+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis.">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707 (2010).</li><li>Wallington, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological Methods for Bone. , (1972).</li><li>Callis, G. M., Sterchi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decalcification+of+bone:+Literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+methods,+and+their+effects+on+bone+histology.">Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology.</a> J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utilization+of+formalin+fixed-paraffin-embedded+specimens+in+high+throughput+genomic+studies.">The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies.</a> Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Trinks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+detection+of+clinically+relevant+features+in+single-cell+RNA+profiles+of+patient-matched+fresh+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+cancer+tissue.">Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue.</a> Cell Oncol (Dordr). , (2024).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single+nucleus+total+RNA+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+by+snRandom-seq.">High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq.</a> Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visium+Spatial+Gene+Expression+Reagent+Kits+for+FFPE+-+User+Guide.,+Document+Number+C+CG000407+Rev+C.">Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C.</a> 10x Genomics. , (2021).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Space+Ranger+Web+Summary+Files+for+Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE+F+FFPEAssay.,+Document+Number+CG000499+Rev+A.">Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A.</a> 10x Genomics. , (2022).</li><li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE-Tissue+Preparation+Guide.,+Document+Number+C+G+CG000408+Rev+D.">Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D.</a> 10x Genomics. , (2022).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, dekalsifiye kemiklerin FFPE bloklarını hazırlamak ve dizileme (yani yeni nesil dizileme (NGS)) veya diğer RNA ile ilgili teknikler (yani in situ hibridizasyon, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), vb.) için RNA bütünlüğünü korumak için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır.
Yöntem, kemik dokusu örneklerini kireçten arındırmak için EDTA'yı kullanır; EDTA inkübasyonu, numunelerin yavaş ama ince demineralizasyonuna izin v...

Kemik, esas olarak kollajen tip 1 liflerinden ve inorganik tuzlar1'den oluşan özel bir bağ dokusudur. Sonuç olarak, kemik inanılmaz derecede güçlü ve serttir, aynı zamanda hafif ve travmaya dayanıklıdır. Kemiğin büyük gücü mineral içeriğinden kaynaklanmaktadır. Aslında, mineral içeriği yüzdesindeki herhangi bir artış için, sertlik beş kat artar2. Sonuç olarak, araştırmacılar, bir kemik örneğinin biyolojisini histolojik kesit yoluyla analiz ettiklerinde önemli problemlerle karşı karşıya kalmaktadırlar.
Kalsifiye edilmemiş kemik histolojisi mümkündür ve bazen araştırmanın türüne bağlı olarak gereklidir (örneğin, kemiğin mikro mimarisini incelemek için); Bununla birlikte, özellikle örnekler büyükse, çok zordur. Bu durumlarda, histolojik amaçlar için doku işleme, standart protokollerin ve tekniklerin çeşitli modifikasyonlarını gerektirir3. Genel olarak, yaygın histolojik değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, kemik dokuları fiksasyondan hemen sonra dekalsifiye edilir, bu işlem dokunun boyutuna ve kullanılan kireç çözücü ajana bağlı olarak birkaç gün ila birkaç hafta sürebilir4. Dekalsifiye bölümler genellikle kemik iliği muayenesi, tümörlerin teşhisi vb. İçin kullanılır. Üç ana kireç çözücü ajan türü vardır: güçlü asitler (örn. nitrik asit, hidroklorik asit), zayıf asitler (örn. formik asit) ve şelatlama ajanları (örn. etilendiaminetetracetic asit veya EDTA)5. Güçlü asitler kemiği çok hızlı bir şekilde kireçten arındırabilir, ancak dokulara zarar verebilir; zayıf asitler çok yaygındır ve teşhis prosedürleri için uygundur; Şelatlama ajanları, araştırma uygulaması için açık ara en çok kullanılan ve uygun olanlardır, çünkü bu durumda, demineralizasyon işlemi yavaş ve naziktir, bu da birçok prosedürün gerektirdiği gibi yüksek kaliteli morfolojinin tutulmasına ve gen ve protein bilgilerinin korunmasına izin verir (örneğin, yerinde hibridizasyon, immün boyama). Bununla birlikte, gen ekspresyon analizleri gibi tüm transkriptomun korunması gerektiğinde, yavaş ve hafif bir demineralizasyon bile zararlı olabilir. Bu nedenle, dokuların morfolojik analizinin hücrelerin gen ekspresyon analizleri ile eşleştirilmesi gerektiğinde daha iyi yaklaşımlara ve yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) ve uzamsal transkriptomikteki son gelişmeler sayesinde, doku örneklerini saklamak için formalin fiksasyon parafin gömme (FFPE) kullanıldığında bile bir doku örneğinin gen ekspresyonunu incelemek artık mümkündür 6,7,8. Bu fırsat, dünya çapında doku bankalarında saklananlar gibi daha fazla sayıda örneğe erişimin kilidini açtı. Eğer scRNA-seq kullanılacaksa, RNA bütünlüğü en önemli gerekliliktir; bununla birlikte, FFPE örneklerinin uzamsal transkriptomikleri söz konusu olduğunda, her doku bölümünün histolojik bağlamında gen ekspresyonunu görselleştirmek için hem yüksek kaliteli doku kesitleri hem de yüksek kaliteli RNA gereklidir. Yumuşak dokularla bu kolayca başarılırken, kemik gibi sert dokular için aynı şey söylenemez. Aslında, bildiğimiz kadarıyla, FFPE kemik örnekleri üzerinde uzamsal transkriptomik kullanan hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bunun nedeni, RNA içeriğini korurken FFPE kemik dokularını etkili bir şekilde işleyebilen protokollerin olmamasıdır. Burada, önce RNA bozulmasını önlerken taze elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek ve kireçten arındırmak için bir yöntem sağlanır. Daha sonra, dünya çapında doku bankalarında toplanan FFPE örneklerinin transkriptomik analizine duyulan ihtiyacın farkında olarak, demineralize edilmemiş kemiklerin FFPE örneklerini uygun şekilde işlemek için geliştirilmiş kılavuzlar da sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76683-470</td>
			<td>Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brushes</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>11859</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Index Kit TS Set A 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000251</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Decon Labs Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S312-500</td>
			<td>Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Fine Precision Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-153</td>
			<td>Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High profile diamond microtome blades</td>
			<td>CL Sturkey</td>
			<td>D554DD</td>
			<td>Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novaseq 150PE</td>
			<td>Novogene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS&#160; to perform tissue fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-049</td>
			<td>Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premiere Tissue Floating Bath&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A84600061</td>
			<td>Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7002</td>
			<td>Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy DSP FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73604</td>
			<td>Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-Automated Rotary Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S8045-500</td>
			<td>Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Space Ranger</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>2.0.1</td>
			<td>Use to process sequencing data output .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Paraplast</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td>Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000194</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Human Transcriptome Probe Kit Small&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000363</td>
			<td>Use to perform spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>PN-1000188</td>
			<td>Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803665</td>
			<td>Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues

Hücreler arasındaki ilişkiyi ve her bir doku içindeki konumlarını anlamak, normal gelişim ve hastalık patolojisi ile ilişkili biyolojik süreçleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Mekansal transkriptomik, doku örnekleri içindeki tüm transkriptomun analizini sağlayan, böylece hücresel gen ekspresyonu ve hücrelerin bulunduğu histolojik bağlam hakkında bilgi sağlayan güçlü bir yöntemdir. Bu yöntem birçok yumuşak doku için yaygın olarak kullanılırken, kemik gibi sert dokuların analizi için uygulanması zor olmuştur. En büyük zorluk, sert doku örneklerini kesitleme için işlerken kaliteli RNA ve doku morfolojisinin korunamamasıdır. Bu nedenle, mekansal transkriptomik verileri etkili bir şekilde oluşturmak için yeni elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek için burada bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, numunelerin dekalsifikasyonuna izin vererek, RNA bozulmasını önlerken korunmuş morfolojik ayrıntılara sahip başarılı doku kesitleri sağlar. Ek olarak, doku bankalarından toplanan numuneler gibi demineralizasyon olmadan daha önce parafine gömülü olan numuneler için ayrıntılı kılavuzlar sağlanmıştır. Bu kılavuzlar kullanılarak, primer tümör ve kemik osteosarkomunun akciğer metastazı doku bankası örneklerinden üretilen yüksek kaliteli mekansal transkriptomik veriler gösterilmektedir.

Bone is a specialized connective tissue comprised mainly of fibers of collagen type 1 and inorganic salts1. As a result, bone is incredibly strong and stiff while being, at the same time, light and trauma-resistant. The great strength of bone derives from its mineral content. In fact, for any given increase in the percentage of mineral content, stiffness increases by five-fold2. Consequently, investigators face significant problems when they analyze, by means of histological sectioning, the biology of a bone specimen.
Undecalcified bone histology is feasible and sometimes required, depending on the type of investigation (e.g., to study the micro-architecture of bone); it is, however, very challenging, especially if the specimens are large. In these cases, tissue processing for histological purposes requires several modifications of the standard protocols and techniques3. In general, to perform common histological evaluations, bone tissues are decalcified right after fixation, a process that may require a few days to several weeks, depending on the size of the tissue and the decalcifying agent utilized4. Decalcified sections are often used for the examination of bone marrow, the diagnosis of tumors, etc. There are three main types of decalcifying agents: strong acids (e.g., nitric acid, hydrochloric acid), weak acids (e.g., formic acid), and chelating agents (e.g., ethylenediaminetetracetic acid or EDTA)5. Strong acids can decalcify bone very rapidly, but they can damage the tissues; weak acids are very common and suitable for diagnostic procedures; chelating agents are by far the most used and appropriate for research application since, in this case, the demineralization process is slow and gentle, allowing for retention of high-quality morphology and preservation of gene and protein information, as required by many procedures (e.g., in situ hybridization, immunostaining). However, when the whole transcriptome needs to be preserved, such as for gene expression analyses, even a slow and gentle demineralization may be detrimental. Therefore, better approaches and methods are needed when the morphological analysis of the tissues needs to be paired with gene expression analyses of the cells.
Thanks to recent improvements in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and spatial transcriptomics, it is now possible to study the gene expression of a tissue specimen even when formalin fixation paraffin embedding (FFPE) was used to store the tissue samples6,7,8. This opportunity has unlocked access to a larger number of samples, such as those stored in tissue banks worldwide. If scRNA-seq is to be employed, RNA integrity is the most important requirement; however, in the case of spatial transcriptomics of FFPE samples, both high-quality tissue sections and high-quality RNA are necessary to visualize the gene expression within the histological context of each tissue section. While this has been easily achieved with soft tissues, the same cannot be said for hard tissues like bone. In fact, to the best of our knowledge, no study using spatial transcriptomics has ever been performed on FFPE bone samples. This is because of the lack of protocols that can effectively process FFPE bone tissues while preserving their RNA content. Here, a method to process and decalcify freshly obtained bone tissue samples while avoiding RNA degradation is provided first. Then, recognizing the need for transcriptomics analysis of the FFPE samples collected in tissue banks worldwide, developed guidelines to properly handle FFPE samples of non-demineralized bones are also presented.

Yazar Spotlight: Mekansal transkriptomik yoluyla osteosarkomda ileri terapötik hedeflerin araştırılması

Kemik Dokularının Mekansal Transkriptomiklerini Etkinleştirme Yöntemleri

Burada sunulan yöntem, RNA bütünlüğünü korurken bir mikrotom ile kolayca kesit alınabilen demineralize FFPE örnekleri elde etmek için yeni izole edilmiş kemiklerin nasıl işleneceğini açıklar (Şekil 1). Yöntem, murin femurlarında başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak benzer boyutlardaki diğer kemik dokusu örnekleri için takip edilebilir veya tüm parametreleri (zamanlama, çözelti hacimleri, vb.) artırarak daha büyük kemik örnekleri (örneğin, insan ö...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Exploring Advanced Therapeutic Targets in Osteosarcoma Through Spatial Transcriptomics at JoVE.com

Burada, taze elde edilen kemik dokularının dekalsifikasyonuna ve yüksek kaliteli RNA'nın korunmasına izin veren bir yöntemi açıklıyoruz. Taze dokuların mevcut olmadığı veya toplanamadığı durumlarda iyi kalitede sonuçlar elde etmek için demineralize edilmemiş kemiklerin Formalin Sabit Parafin Gömülü (FFPE) örneklerini kesitlemek için bir yöntem de gösterilmiştir.

Understanding the relationship between the cells and their location within each tissue is critical to uncover the biological processes associated with ...

Amacımız, osteosarkom adı verilen bir insan kemik kanserini tedavi etmek için daha iyi terapötik yaklaşımlar bulmaktır. Bunu yapmak için, bu tümörün başlangıcından ve her şeyden önce metastazının gelişiminden sorumlu olan biyolojik süreçleri ortaya çıkarmak istiyoruz, bu da hastanın ölüm nedenini ortadan kaldırıyor. İnsan primer osteosarkom hattı metastazının birkaç eşleşen örneği üzerinde mekansal transkriptomik analiz kullanarak, tümöral alanlarda bulunan çok sayıda hasta ortak hücre popülasyonunu bulduk ve bunları karşılaştırarak, akciğer metastazını önlemek için değerli terapötik hedefleri temsil edebilecek birkaç anahtar gen belirledik.Kemik gibi kalp dokusunun özel transkriptomik analizi, aynı zamanda kalp dokusunu kesit almak için işlerken, aynı zamanda kaliteli RNA ve doku morfolojisini koruyamama nedeniyle çok zor olmuştur. Protokolümüz bu boşluğu ele alarak araştırmacıların özel transkriptomik analizleri kalp dokularına da başarılı bir şekilde uygulamalarına olanak tanır.

methods-to-enable-spatial-transcriptomics-of-bone-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Enable Spatial Transcriptomics of Bone Tissues

2.0K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Dental Medicine. Amacımız, osteosarkom adı verilen bir insan kemik kanserini tedavi etmek için daha iyi terapötik yaklaşımlar bulmaktır. Bunu yapmak için, bu tümörün başlangıcından ve her şeyden önce metastazının gelişiminden sorumlu olan biyolojik süreçleri ortaya çıkarmak istiyoruz, bu da hastanın ölüm nedenini ortadan kaldırıyor. İnsan primer osteosarkom hattı metastazının birkaç eşleşen örneği üzerinde mekansal transkriptomik analiz kullanarak, tümöral alanlarda bu...

Video: Yazar Spotlight: Mekansal transkriptomik yoluyla osteosarkomda ileri terapötik hedeflerin araştırılması

Understanding the relationship between the cells and their location within each tissue is critical to uncover the biological processes associated with normal development and disease pathology. Spatial transcriptomics is a powerful method that enables the analysis of the whole transcriptome within tissue samples, thus providing information about the cellular gene expression and the histological context in which the cells reside. While this method has been extensively utilized for many soft tissues, its application for the analyses of hard tissues such as bone has been challenging. The major challenge resides in the inability to preserve good quality RNA and tissue morphology while processing the hard tissue samples for sectioning. Therefore, a method is described here to process freshly obtained bone tissue samples to effectively generate spatial transcriptomics data. The method allows for the decalcification of the samples, granting successful tissue sections with preserved morphological details while avoiding RNA degradation. In addition, detailed guidelines are provided for samples that were previously paraffin-embedded, without demineralization, such as&#160;samples collected from tissue banks. Using these guidelines, high-quality spatial transcriptomics data generated from tissue bank samples of primary tumor and lung metastasis of bone osteosarcoma are shown.

Here, we describe a method that allows for the decalcification of freshly obtained bone tissues and the preservation of high-quality RNA. A method is also illustrated for sectioning Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) samples of non-demineralized bones to obtain good quality results if fresh tissues are not available or cannot be collected.