في مختبري ، نقوم بهندسة العلاجات الخلوية من الجيل التالي من خلال الجمع بين هندسة البروتين والهندسة الخلوية. لذلك نقوم بهندسة مكونات البروتين للحصول على وظائف جديدة أو لتحسين الوظائف الحالية ، ثم ندمج هذه البروتينات الفارغة في العلاجات الخلوية. لقد قمنا بتطوير عرض سطح الاستخدام للتطبيقات المتخصصة بما في ذلك هندسة استقرار البروتين ، وهندسة مفاتيح البروتين المنظمة للجزيئات الصغيرة ، والاستهداف المحدد لتأكيدات المستقبلات المنشطة المرتبطة بالسرطان.
تتمثل ميزة عرض سطح الخميرة مقارنة بتقنيات العرض الأخرى مثل العاثيات أو عرض الريبوسوم في التصور الخلوي للتدفق للمكتبة أثناء عملية الفرز والتحكم الدقيق في ظروف الاختيار ، مثل تركيز المستضد وصرامة بوابة الفرز. للبدء ، قم بإعداد الخرزات لاختيار الخرزة الأولى عن طريق تعليق 10 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي المرتبط بالبيوتين في 990 ميكرولتر من PBSA. للغسيل ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين مع فتح الغطاء.
ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخرزات المغسولة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل في مليلتر واحد من PBSA مع 6.7 إلى 33 بيكومول من مستضد البيوتينيل. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين مع فتح الغطاء ، وقم بإزالة المادة الطافية واغسل الخرز المحمل بالمستضد بمليلتر واحد من PBSA.
بمجرد أن تستقر الخرزات ، قم بإزالة PBSA. ثم أعد تعليق الخرز المحمل بالمستضد في 50 ميكرولتر من PBSA. تحضير الخلايا وخرز المستضد ومحلول حبات الدب للاختيارات السلبية.
بعد الغسيل ، قم بتعليق حبات المستضد في 50 ميكرولتر من PBSA وأعد تعليق حبات الدب في 150 ميكرولتر من PBSA. للاختيار السلبي الأول ، أضف 50 ميكرولترا من الخرز العارية المغسولة إلى 950 ميكرولتر من الخلايا المغسولة في PBSA واحتضن الخليط لمدة 1.5 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب التي تحتوي على معلقات خلية حبة الدب على رف مغناطيسي مع فتح الغطاء.
ماصة أي سائل في الغطاء في الأنبوب ، وانتظر لمدة دقيقتين. ثم انقل الخلايا غير المنضمة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 50 ميكرولترا من حبات الدب المغسولة. بعد ثلاث جولات من الاختيار السلبي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول الخرزة المحمل بالمستضد إلى الخلايا.
احتضان لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. الآن ضع الخلايا التي تحتوي على الخرز المحمل بالمستضد على رف مغناطيسي مع فتح الغطاء. ماصة أي سائل موجود في الغطاء في الأنبوب.
انتظر لمدة دقيقتين قبل التخلص من الخلايا غير المنضومة. قم بتنفيذ جميع الخطوات المتبقية كما هو موضح لاختيار حبة المستضد الأولى. بعد ثلاثة اختيارات سلبية وواحدة إيجابية ، قم بتعليق الخلايا بسرعة في مليلتر واحد من SDCAA ونقلها إلى قارورة شاكر تحتوي على حجم أكبر من SDCAA.
بعد الحث بين عشية وضحاها للتعبير السطحي عن البروتينات في SGCAA في مكتبات الخميرة ، قم بحفر خلايا كافية لتغطية 10 أضعاف التنوع والتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في PBSA وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. استخدم 30 مليون خلية للتلطيخ في كل أنبوب.
قم بإعداد أكبر عدد ممكن من الأنابيب حسب الحاجة بناء على التنوع ، بما في ذلك أنبوب تحكم واحد بدون المستضد. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 2000 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBSA التي تحتوي على المستضد ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.
بعد إجراء الطرد المركزي مرة أخرى ، قم بإزالة PBSA من الحبيبات. بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBSA البارد الذي يحتوي على أجسام مضادة لتلطيخ العرض واكتشاف المستضد. احتضن لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 2000 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. أضف ملليلتر واحد من PBSA إلى الحبيبات وكرر الطرد المركزي. ثم قم بإزالة معظم المادة الطافية ، ولم يتبق سوى 20 إلى 30 ميكرولترا لمنع الجفاف من الحبيبات.
أعد تعليق الحبيبات في PBSA البارد قبل الفرز مباشرة. الآن قم بفرز الخلايا مباشرة إلى SDCAA وسيط. بعد الفرز ، انقل الخلايا إلى قارورة شاكر تحتوي على حجم أكبر من وسط SDCAA وتحتضن عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة.
