酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

私の研究室では、タンパク質工学と細胞工学を組み合わせ、次世代の細胞治療を行っています。そこで、新しい機能を獲得したり、既存の機能を改良したりするためにタンパク質成分を操作し、これらのヌルタンパク質を細胞治療薬に組み込みます。私たちはさらに、タンパク質安定性工学、低分子制御タンパク質スイッチのエンジニアリング、がん関連活性化受容体の特異的標的化確認など、特殊なアプリケーションのための使用表面ディスプレイを開発しました。

ファージやリボソームディスプレイなどの他のディスプレイ技術と比較した酵母表面ディスプレイの利点は、ソーティングプロセス中のライブラリのフローサイトメトリー可視化と、抗原濃度やソーティングゲートのストリンジェンシーなどの選択条件の正確な制御です。まず、10マイクロリットルのビオチンバインダー磁気ビーズを990マイクロリットルのPBSAに再懸濁することにより、最初のビーズ選択用のビーズを準備します。洗浄するには、蓋を開けた状態でチューブを磁気ラックに2分間置きます。

次に、上清を慎重に取り除きます。洗浄したビーズを、6.7〜33ピコモルのビオチン化抗原を含むPBSA1ミリリットルの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに再懸濁します。インキュベーション後、チューブを蓋を開けた状態で磁気ラックに2分間置き、上清を取り除き、抗原を充填したビーズを1ミリリットルのPBSAで洗浄します。

ビーズが落ち着いたら、PBSAを取り外します。次に、抗原をロードしたビーズを50マイクロリットルのPBSAに再懸濁します。ネガティブセレクション用の細胞、抗原ビーズ、およびベアビーズの溶液を調製します。

洗浄後、抗原ビーズを50マイクロリットルのPBSAに再懸濁し、ベアビーズを150マイクロリットルのPBSAに再懸濁します。最初のネガティブセレクションでは、PBSA中の950マイクロリットルの洗浄細胞に50マイクロリットルの洗浄ベアビーズを加え、混合物を摂氏4度で1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、ベアビーズ細胞懸濁液が入ったチューブを、蓋を開けた状態で磁気ラックに置きます。

蓋の中の液体をチューブにピペットで入れ、2分間待ちます。次に、結合していない細胞を新しいマイクロ遠心チューブに移し、洗浄したベアビーズを50マイクロリットル加えます。ネガティブセレクションを3回行った後、50マイクロリットルの抗原充填ビーズ溶液を細胞に加えます。

摂氏4度で2時間インキュベートします。次に、抗原をロードしたビーズを含む細胞を、蓋を開けた状態で磁気ラックに置きます。蓋の中にある液体をチューブにピペットで入れます。

2分間待ってから、バインドされていないセルを破棄します。最初の抗原ビーズの選択について説明したように、残りのすべてのステップを実行します。3回のネガティブ選択と1回のポジティブ選択の後、細胞を1ミリリットルのSDCAAに急速に再懸濁し、大量のSDCAAを含むシェーカーフラスコに移します。

酵母ライブラリーのSGCAAでタンパク質の表面発現を一晩誘導した後、多様性の10倍をカバーするのに十分な細胞をペレット化し、上清を廃棄します。ペレットをPBSAに再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移します。各チューブで3,000万個の細胞を染色します。

抗原を含まないコントロールチューブ1本を含め、多様性に基づいて必要な数のチューブを準備します。次に、チューブを2000 x gで室温で5分間遠心分離します。ペレットを抗原を含む200マイクロリットルのPBSAに再懸濁し、摂氏4度で1時間インキュベートします。

再度遠心分離を行った後、ペレットからPBSAを除去します。次に、ディスプレイ染色および抗原検出のために、100 μリットルの低温PBSA含有抗体に細胞を再懸濁します。摂氏4度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞を2000 x gで4°Cで5分間遠心分離します。ペレットに1ミリリットルのPBSAを加え、遠心分離を繰り返します。次に、ペレットが乾燥するのを防ぐために、上澄みの大部分を取り除き、20〜30マイクロリットルだけを残します。

選別する直前に、ペレットを冷たいPBSAに再懸濁します。次に、細胞を直接SDCAA培地に選別します。選別後、細胞を大量のSDCAA培地を含むシェーカーフラスコに移し、摂氏30度でインキュベートし、180RPMで振とうします。