효모 표면 디스플레이에 의한 단백질 공학

제 연구실에서는 단백질 공학과 세포 공학을 결합하여 차세대 세포 치료법을 엔지니어링하고 있습니다. 그래서 우리는 새로운 기능을 얻거나 기존 기능을 개선하기 위해 단백질 구성 요소를 엔지니어링한 다음, 이러한 null 단백질을 세포 치료제에 통합합니다. 우리는 단백질 안정성 엔지니어링, 저분자 조절 단백질 스위치 엔지니어링, 암 관련 활성화 수용체 확인의 특정 표적화를 포함한 특수 응용 분야를 위한 사용 표면 디스플레이를 추가로 개발했습니다.

파지 또는 리보솜 디스플레이와 같은 다른 디스플레이 기술과 비교했을 때 효모 표면 디스플레이의 장점은 분류 프로세스 중 라이브러리의 유세포 분석을 시각화하고 항원 농도 및 분류 게이트의 엄격함과 같은 선택 조건을 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다. 먼저 10마이크로리터의 비오틴 바인더 마그네틱 비드를 990마이크로리터의 PBSA에 재현탁하여 첫 번째 비드 선택을 위해 비드를 준비합니다. 세척을 위해 뚜껑을 연 상태에서 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 올려 놓습니다.

그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 세척된 비드를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 PBSA에 6.7 - 33피코몰의 비오틴화 항원과 함께 재현탁합니다. 배양 후 뚜껑을 연 상태에서 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓고 상층액을 제거한 다음 항원이 로드된 비드를 PBSA 1ml로 세척합니다.

비드가 가라앉으면 PBSA를 제거합니다. 그런 다음 항원이 로드된 비드를 50마이크로리터의 PBSA에 다시 현탁시킵니다. 세포, 항원 비드 및 곰 비드 용액을 negative selection을 위해 준비합니다.

세척 후 항원 비드를 50마이크로리터의 PBSA에 재현탁시키고 150마이크로리터의 PBSA에 곰 비드를 재현탁합니다. 첫 번째 음성 선택의 경우, PBSA에서 세척된 세포 950마이크로리터에 세척된 베어 비드 50마이크로리터를 추가하고 혼합물을 섭씨 4도에서 1.5시간 동안 배양합니다. 배양 후, 곰 구슬 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 뚜껑을 연 상태로 마그네틱 랙에 놓습니다.

뚜껑에 있는 액체를 튜브에 피펫으로 넣고 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 결합되지 않은 세포를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 세척된 곰 구슬 50마이크로리터를 추가합니다. 3차례의 negative selection 후, 50마이크로리터의 항원 로딩 비드 용액을 세포에 첨가합니다.

섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 항원이 로드된 비드가 들어 있는 세포를 뚜껑을 연 상태로 마그네틱 랙에 놓습니다. 뚜껑에 있는 모든 액체를 튜브에 피펫으로 넣습니다.

바인딩되지 않은 셀을 버리기 전에 2분 동안 기다립니다. 첫 번째 항원 비드 선택에 대해 설명된 대로 나머지 모든 단계를 수행합니다. 3회 음성 선별 및 1회 양성 선택 후 1ml의 SDCAA에 세포를 빠르게 재현탁하고 더 많은 양의 SDCAA를 함유한 셰이커 플라스크로 옮깁니다.

효모 라이브러리에서 SGCAA의 단백질 표면 발현을 하룻밤 사이에 유도한 후, 다양성의 10배를 커버할 수 있을 만큼 충분한 세포를 펠릿화하고 상층액을 버립니다. 펠릿을 PBSA에 재현탁시키고 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에서 염색을 위해 3,000만 개의 세포를 사용합니다.

항원이 없는 하나의 대조 튜브를 포함하여 다양성에 따라 필요한 만큼 튜브를 준비합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 2000 x g의 튜브를 원심분리합니다. 항원을 함유한 200마이크로리터의 PBSA에 펠릿을 재현탁시키고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

다시 한 번 원심분리를 수행한 후 펠릿에서 PBSA를 제거합니다. 다음으로, 디스플레이 염색 및 항원 검출을 위한 항체가 포함된 100마이크로리터의 저온 PBSA에 세포를 재현탁합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후 2000 x g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 펠릿에 PBSA 1ml를 넣고 원심분리를 반복합니다. 그런 다음 펠릿이 마르는 것을 방지하기 위해 20-30 마이크로 리터 만 남기고 대부분의 상등액을 제거하십시오.

분류 직전에 펠릿을 차가운 PBSA에 재현탁합니다. 이제 세포를 배지인 SDCAA로 직접 분류합니다. 분류 후 더 많은 양의 SDCAA 배지를 함유한 셰이커 플라스크로 세포를 옮기고 180RPM으로 진탕하면서 섭씨 30도에서 배양합니다.