تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى J.H. من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81800207). إن مساعدة شركة Beckman Coulter، Inc. في تقديم الدعم لقياس التدفق الخلوي ومعايرة المعلمات موضع تقدير كبير. نشكر جياو تشن من مختبر الدولة الرئيسي لأمراض الفم ، مستشفى غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان ، ويو تشي من مركز أبحاث الطب التجديدي ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، لمساعدتهم في الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي.

استخدمت التجارب في هذه الدراسة ما مجموعه 10 فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا. أجريت العمليات التجريبية وفقا لبروتوكول تمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سيتشوان (# 201609309). يتم سرد المواد التجريبية ومعلمات قياس التدفق الخلوي المستخدمة في هذه المقالة في جدول المواد.
1. عزل وجمع خلايا نخاع عظم الفأر
<ol><li>القتل الرحيم للفئران بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية. للحث على فقدان الوعي في الفأر ، يتم تطبيق التخدير بالاستنشاق بدءا من 2٪ إيزوفلوران ، تليها زيادة تدريجية في الجرعة إلى 5٪ إيزوفلوران حتى توقف التنفس.</li>
	<li>تشريح الفئران في الجناح الجراحي أو خزانة الدخان. تنظيف وتعقيم الفئران مع 70 ٪ من الإيثانول.</li>
	<li>قطع الجلد والعضلات في الساق بمقص حاد تماما وتشريح عظم الفخذ.</li>
	<li>سحق عظم الفخذ برفق بقضيب طحن في هاون واطرد خلايا نخاع العظم بوسط DMEM حتى يتحول العظم إلى اللون الأبيض.</li>
	<li>قم بتصفية خلايا نخاع العظم التي تم الحصول عليها باستخدام مرشح 100 ميكرومتر في أنابيب سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تخلص من الخلايا الحمراء الطافية وتحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية مع 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اغسل مرة أخرى باستخدام وسط DMEM.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول الحضانة (وسط DMEM + 5٪ FBS) ، وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي واضبط تركيز الخلية على 1.0 × 106 خلايا / مل مع محلول الحضانة.</li>
</ol>2. تلطيخ الخلوية
<ol><li>ملحق 2 مل من معلق خلايا نخاع العظم من كل فأر مع 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342. إلى 1 مل أخرى من القسمة ، أضف 100 ميكرومتر فيراباميل كعنصر تحكم سلبي.</li>
	<li>احتضن في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع تحريك لطيف كل 30 دقيقة.</li>
	<li>بعد الحضانة ، قم بتبريد الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في محلول تشغيل بارد (HBSS + 2٪ FBS). أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.</li>
	<li>أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في 500 ميكرولتر من محلول التشغيل لكل عينة. قبل تحليل FCM ، استكمل الخلايا ب 2 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (PI) وضعها على الجليد لمدة 5 دقائق تقريبا.</li>
</ol>3. قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: للحصول على ملخص لمختلف الأنظمة والتكوينات المستخدمة، يرجى الاطلاع على الجدول 1.
<ol><li>معايرة قيم معامل الاختلاف (CV) للقنوات المطلوبة باستخدام الفلوروسفير اليومي لمراقبة الجودة (QC) في FCMs وإجراء اختبار العينات بعد الانتهاء بنجاح من مراقبة الجودة.<ol><li>حدد اختصار سطح المكتب للبرنامج وقم بتشغيل البرنامج.</li>
		<li>حدد بدء مراقبة الجودة/التوحيد القياسي في قائمة مراقبة الجودة/التوحيد القياسي للوصول إلى تجربة مراقبة الجودة.</li>
		<li>أدخل أنبوب عينة الفلوروسفير QC في حامل الأنبوب.</li>
		<li>حدد البدء لتحميل العينة والبدء في تشغيل إجراء مراقبة الجودة. FCMs جاهزة للاستخدام بعد مرور مراقبة الجودة.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بإثارة صبغة Hoechst 33342 لنفس العينات باستخدام ليزر 355 نانومتر و 375 نانومتر و 405 نانومتر ، على التوالي ، للكشف عن أحمر Hoechst في قناة 690/50 نانومتر و Hoechst blue في قناة 450/50 نانومتر.<ol><li>قم بإنشاء تجربة جديدة عن طريق تحديد تجربة جديدة في القائمة ملف، وحدد مسار الملف، واحفظ التجربة.</li>
		<li>حدد تعيين القناة في قائمة الإعدادات. حدد خانة الاختيار إشارة القناة (Y585، V450، V660، NUV450، NUV660، UV450، UV660)، ثم أضف اسم الكاشف في عمود التسمية (Y585: PI; V450: هويشت بلو-405 نانومتر؛ V660: هويشت الأحمر 405 نانومتر ؛ NUV450: هويشت بلو-375 نانومتر ؛ NUV660: هويشت بلو-375 نانومتر ؛ UV450: هويشت بلو -355 نانومتر ؛ UV660: هويشت بلو-355 نانومتر).</li>
		<li>انقر فوق أيقونات مخططات الألوان الزائفة في منطقة الرسم لإنشاء مؤامرات. حدد اسم محور لتغيير القناة التي يتم عرضها.</li>
		<li>انقر فوق إضافة أنبوب في شاشة أنبوب الاختبار لإنشاء أنابيب عينة جديدة وتغيير أسمائها.</li>
		<li>حدد تشغيل لتحميل العينة وعرض المؤامرات وإنشاء البوابات. اضبط إعدادات الكسب والعتبة. حدد سجل لحفظ البيانات.</li>
	</ol></li>
	<li>تصميم منطق إعداد البوابة.<ol><li>بالنسبة للمخطط الأول ، انقر فوق المحور X لتحديد FSC-W وانقر فوق المحور Y لتحديد FSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة A لوضع دائرة حول الخلية الفردية واستبعاد الخلايا الملتصقة (الشكل 1A).</li>
		<li>بالنسبة للمخطط الثاني ، انقر فوق المحور X لتحديد FSC-A وانقر فوق المحور Y لتحديد SSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة B لفصل الخلايا غير المجزأة واستبعاد الحطام الخلوي (الشكل 1B).</li>
		<li>بالنسبة للمخطط الثالث ، انقر فوق المحور X لتحديد PI-A وانقر فوق المحور Y لتحديد SSC-A. حدد بوابة المضلع لرسم البوابة D. حدد الخلايا الحية التي تظهر PI سالبة (الشكل 1C) وارسم البوابة C للحصول على الخلايا الحية.</li>
		<li>بالنسبة للمخطط الرابع ثنائي الأبعاد ، انقر فوق المحور X لتحديد Hoechst Red وانقر فوق المحور Y لتحديد Hoechst Blue. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المؤامرة وحدد خاصية من القائمة المنسدلة. حدد التنسيق الخطي fأو كلا المحور X والمحور Y. حدد بوابة المضلع لرسم بوابة SP للحصول على خلايا SP (الشكل 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>لتقييم أهلية العينة ، استخدم 355 نانومتر من مقياس التدفق الخلويالمحدد 23 لاكتشاف خلية SP.</li>
	<li>استخدم ليزر 355 نانومتر (طاقة الليزر: 20 ميجاوات) و 405 نانومتر (طاقة الليزر: 80 ميجاوات) في وقت واحد لاكتشاف كل من خلايا التحكم (مع إضافة فيراباميل) والخلايا التجريبية.</li>
	<li>الحصول على إشارات مضان عند قنوات 690/50 نانومتر و 450/50 نانومتر المقابلة لليزرتين. راقب التحفيز الفعال لصبغة Hoechst 33342 بواسطة ليزر 355 نانومتر و 405 نانومتر مع خلايا SP واضحة (الشكل 2B-C).</li>
	<li>بالنسبة لنفس العينات ، استخدم ليزر 375 نانومتر (طاقة الليزر: 60 ميجاوات) و 405 نانومتر (طاقة الليزر: 80 ميجاوات) لاكتشاف الخلايا.</li>
</ol>

طريقة الإثارة بالليزر البديلة للكشف السهل عن الخلايا السكانية الجانبية

<ol>
	<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1.">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells.">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li><li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li><li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity.">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li><li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+'side+population'.">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li><li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li><li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+stem+cells:+still+an+elusive+entity.">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64 (2017).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination.">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322 (2022).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties.">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178 (2021).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system.">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+PTEN/mTOR/STAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance.">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population.">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136 (2022).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway.">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538 (2021).</li><li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines.">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658 (2021).</li><li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform.">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li></ol>

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

استخدمنا البروتوكول الموصوف لإجراء ثلاث تجارب ، كل تجربة شملت 3-4 فئران ، مما أدى إلى ما مجموعه 10 فئران. تراوحت نسبة خلايا SP من 0.05٪ إلى 0.76٪. من المهم أن نلاحظ أنه لوحظت اختلافات فردية بين الفئران. استخدمنا أربعة مقاييس للتدفق الخلوي لتحليل عينات Hoechst. لوحظ أن إثارة صبغة Hoechst بواسطة ليزر 20 mW 355 nm...

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). تتميز خلايا SP بضخ صبغة الحمض النووي الفلورية خارج الخلايا من خلال ناقل الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) 1,2. تم إنشاء هذه الطريقة في الأصل لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع عظم الفئران (HSCs) 1. تم إثراء خلايا نخاع العظم SP بمجموعة من HSCs تتميزبتعبير منخفض CD117 + Sca-1 + Lin-Thy1 3,4. بعد ذلك ، تم استخدام الطريقة على نطاق واسع لعزل وإثراء الخلايا الجذعية من الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك عضلة القلب5 والكبد6 والرئة7 والكلى8 والدماغ الأمامي9. على وجه الخصوص ، تم تطبيق الطريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في العقد الماضي. تمثل الخلايا الجذعية السرطانية مجموعة صغيرة من الخلايا التي تمتلك خصائص بدء الورم ، والتجديد الذاتي ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والإمكانات النقيلية10. تم تحديد الخلايا الجذعية السرطانية في البداية في الأورام الخبيثة المكونة للدم11 ولوحظت لاحقا في أورام صلبة مختلفة مثل سرطان البروستاتا12 والمبيض13 والمعدة14 والثدي15 والرئة16. على الرغم من توفر تقنيات مختلفة لتحديد CSC ، تظل تقنية SP خيارا مفضلا نظرا لتطبيقها الواسع عبر الأنسجة وخطوط الخلايا المتنوعة. علاوة على ذلك ، فهي تقنية قيمة تعزل الخلايا الجذعية السرطانية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 16،17،18. تظهر النتائج التجريبية أن خلايا SP تظهر ورما واضحا وتعرض مستويات تعبير مرتفعة للجينات المرتبطة بالخلايا الجذعية19,20. أظهرت دراستنا السابقة21 أيضا أن التحليل النسخي لخلايا SP المعزولة في المايلوما المتعددة يكشف عن إثراء مسارات الإشارات المرتبطة بالخلايا الجذعية ، مثل مسار القنفذ. وفي الوقت نفسه ، أجرينا تحليلات إثراء المسار على الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في خلايا SP لسرطان الدم النقوي الحاد22. تم إثراء الجينات المعدلة في المسارات المتعلقة بالخلايا الجذعية (Wnt / β-catenin ، TGF-β ، Hedgehog ، Notch). وجدنا أن خلايا 1 × 105 SP يمكن أن تشكل أوراما في الفئران الخالية من BALB / c22 ، في حين أن الخلايا غير SP لا تستطيع ذلك ، مما يشير إلى أن خلايا SP لها خصائص الخلايا الجذعية لسرطان الدم. فعالية طريقة Hoechst SP في تحديد CSCs واضحة.
تم تنقيح بروتوكول Hoechst SP وتعزيزه من خلال تقدم البحث. يستلزم البروتوكول رقابة صارمة على تركيز الصبغة وكثافة الخلية ودرجة حرارة الحضانة ومدتها وتكوين المخزن المؤقت وقيمة الأس الهيدروجيني. خضعت عينات الخلايا المحضرة وفقا لهذا البروتوكول لتحليل التدفق الخلوي. نظرا لإثارة صبغة Hoechst بليزر الأشعة فوق البنفسجية عند 355 نانومتر والكشف عن انبعاث التألق باستخدام كل من مرشح 690/50 نانومتر (Hoechst Red) ومرشح 450/50 نانومتر (Hoechst Blue) ، يلزم وجود ليزر 350 نانومتر ل FCM. ومع ذلك ، لا يتم تجهيز ليزر 350 نانومتر بشكل شائع في معظم أجهزة FCM بسبب تكلفتها العالية. ومن ثم ، حاولنا إيجاد نهج بديل لإثارة الصبغة للكشف الفعال عن خلايا SP عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، تم تقييم قدرة الليزر 375 نانومتر و 405 نانومتر في الكشف عن خلايا SP ومقارنتها بقدرة الليزر 355 نانومتر. تظهر النتائج التي توصلنا إليها تشابها ملحوظا بين خلايا SP المكتشفة بواسطة ليزر 355 نانومتر و 375 نانومتر و 405 نانومتر. تشير هذه النتائج إلى أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يكون بمثابة بدائل مجدية لليزر 355 نانومتر للكشف عن خلايا SP. إن تضمين مصادر ضوء إثارة إضافية ل Hoechst 33342 يسهل استخدام المزيد من نماذج قياس التدفق الخلوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>1M1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filter(100 &#181;m)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CSS-013-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daily quality control fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30030.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective detection of hoechst side population cells by flow cytometry

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). يتم استخدام طريقة Hoechst SP لعزل الخلايا الجذعية بناء على خصائص تدفق الصبغة لناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC). تم استخدام هذه الطريقة في البداية لتحديد وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، لكنها تطورت الآن للتركيز بشكل أساسي على تحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs). تستخدم طريقة الكشف التقليدية ل FCM ليزر 355 نانومتر لإثارة الصبغة للكشف عن خلايا SP. من خلال هذه الدراسة ، نجحنا في تحديد طرق بديلة لإثارة الصبغة التي يمكن أن تحل محل اكتشاف خلايا SP بشكل فعال باستخدام ليزر 355 نانومتر. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام ليزر 375 نانومتر أو 405 نانومتر عالي الطاقة. هذا يسمح لنا بممارسة انتقائية معززة في الكشف عن خلايا SP بدلا من أن تقتصر فقط على قياس التدفق الخلوي بالليزر 355 نانومتر.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The SP cells are characterized by the pumping of the fluorescent DNA dye out of the cells through their ATP-binding cassette (ABC) transporter1,2. The method was originally established for isolating murine bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)1. The bone marrow SP cells were enriched with a population of HSCs characterized by &#160;CD117+Sca-1+Lin-Thy1low&#160;expression3,4. Thereafter, the method was widely used to isolate and enrich stem cells from other tissues, including cardiac muscle5, liver6, lung7, kidney8, and forebrain9. In particular, the method has been applied to isolate cancer stem cells (CSCs) in the past decade. CSCs represent a small population of cells that possess the properties of tumor initiation, self-renewal, resistance to chemotherapy, and metastatic potential10. CSCs were initially identified in hematopoietic malignancies11 and subsequently observed in various solid tumors such as the prostate12, ovarian13, gastric14, breast15, and lung16 carcinomas. Despite the availability of various techniques for CSC identification, the SP technique remains a favored choice owing to its broad applicability across diverse tissues and cell lines. Moreover, it is a valuable technique that isolates CSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS)16,17,18. The experimental findings demonstrate that SP cells exhibit pronounced tumorigenicity and display elevated expression levels of stem cell-associated genes19,20. Our previous study21 has also demonstrated that transcriptomic analysis of isolated SP cells in multiple myeloma reveals enrichment of signaling pathways associated with stem cells, such as the hedgehog pathway. Meanwhile, we performed pathway enrichment analyses on the genes differentially expressed in the SP cells of acute myelogenous leukemia22. The altered genes were enriched in stem cell-related pathways (Wnt/&#946;-catenin, TGF-&#946;, Hedgehog, Notch). We found that 1 x 105 SP cells could form tumors in BALB/c null mice22, whereas non-SP cells could not, indicating that SP cells had characteristics of leukemia stem cells. The efficacy of the Hoechst SP method in the identification of CSCs is evident.
The Hoechst SP protocol has been refined and enhanced through the progression of research. The protocol entails stringent control of the dye concentration, cell density, incubation temperature and duration, buffer composition, and pH value. The cell samples prepared in accordance with this protocol were subjected to flow cytometric analysis. Due to the excitation of Hoechst dye with a UV laser at 355 nm and detection of its fluorescence emission using both a 690/50 nm filter (Hoechst Red) and 450/50 nm filter (Hoechst Blue), a 350 nm laser is required for FCM. However, 350 nm lasers are not commonly equipped in most FCMs because of their high cost. Hence, we attempted to find an alternate approach for&#160;dye excitation for the effective detection of SP cells by flow cytometry. In this study, the capability of the 375 nm and 405 nm lasers in detecting SP cells was assessed and compared with that of the 355 nm laser. Our findings demonstrate a remarkable similarity between the SP cells detected by the 355 nm, 375 nm, and 405 nm lasers. These results suggest that the high-power 375 nm and 405 nm lasers can serve as feasible alternatives to the 355 nm laser for SP cell detection. The inclusion of additional excitation light sources for Hoechst 33342 facilitates the use of more flow cytometry models.

تسليط الضوء على المؤلف: تقنيات الليزر المبتكرة لتلطيخ Hoechst لتحليل الخلايا السكانية الجانبية

الكشف الفعال عن الخلايا السكانية الجانبية Hoechst عن طريق قياس التدفق الخلوي

We use the Hoechst stain population method to detect tumor initiating cells. In this paper, we're trying to find alternative approaches for Hoechst excitation. We found that the high power 375 nanometer and 405 nanometer lasers can serve as feasible alternatives to the traditional 355 millimeter laser.Conventionally, the Hoechst dye is excited with a UV laser at 355 nanometer. Due to the high cost of the UV lasers, they're not commonly equipped in most flow cytometry models. Our protocol expands a range of the lasers that can be used to detect Hoechst staining.For researchers focusing on normal and malignant stem cells, more models of flow cytometry can be used to detect cytopopulation cells.

في الشكل 2 ، عولجت المجموعة الضابطة بالفيراباميل ، الذي يمنع ناقلات ABC في الخلايا الجذعية لمنع التخلص من Hoechst 33342. وبالتالي ، فإن الخلايا الجذعية في المجموعة غير فيراباميل تطرد Hoechst 33342 وتشكل مجموعة خلايا سالبة تعرف باسم خلايا SP. أثار ليزر 355 نانومتر صبغة Hoechst 33342 بشكل فعال ، مم...

هنا ، نظهر أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يثير بشكل فعال Hoechst 33342 ويعمل كبديل قابل للتطبيق لليزر 355 نانومتر لاكتشاف خلايا السكان الجانبية (SP) ، وبالتالي توسيع نطاق الليزر المتاح في تطبيقات قياس التدفق الخلوي.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

effective-detection-of-hoechst-side-population-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

504 Views.  Sichuan University. نستخدم طريقة Hoechst لسكان البقع للكشف عن الخلايا التي تبدأ الورم. في هذه الورقة ، نحاول إيجاد طرق بديلة لإثارة Hoechst. وجدنا أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يكون بمثابة بدائل مجدية لليزر التقليدي 355 ملم.تقليديا ، يتم إثارة صبغة Hoechst باست?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تقنيات الليزر المبتكرة لتلطيخ Hoechst لتحليل الخلايا السكانية الجانبية

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized for the isolation of stem cells based on the dye efflux properties of ATP-binding cassette (ABC) transporters. The method was initially employed for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs), but it has now evolved to primarily focus on the identification and isolation of cancer stem cells (CSCs). The traditional detection method of FCM uses a 355 nm laser to excite the dye to detect SP cells. Through this study, we have successfully identified alternative approaches for dye excitation that can effectively replace the detection of SP cells using a 355 nm laser. This is achieved through the utilization of high-power 375 nm or 405 nm lasers. This allows us to exercise enhanced selectivity in the detection of SP cells rather than being solely limited to the 355 nm laser flow cytometry.

Here, we show that high-power 375 nm and 405 nm lasers can effectively excite Hoechst 33342 and serve as a viable alternative to the 355 nm laser for side population (SP) cell detection, thereby expanding the range of available lasers in flow cytometry applications.

Staining Mouse Bone Marrow Cells with Hoechst to Detect Side Population Cells by Flow Cytometry

To begin, obtain bone marrow cells from the mouse and add five micrograms per milliliter Hoechst 33342 to two milliliters of cell suspension. Prepare the negative control tube as well. Incubate in a water bath at 37 degrees Celsius for 90 minutes with gentle agitation every 30 minutes After incubation, cool the cells on ice for five minutes, and then centrifuge at 250G for five minutes at four degrees Celsius.Resuspend the cells in a cold running solution containing Hank's Balanced Salt Solution with 2%FBS. Centrifuge again at four degrees Celsius for five minutes. Next, resuspend the resulting cell pellet in 500 microliters of running solution per sample.Prior to flow cytometry analysis, supplement cells with two micrograms per milliliter of propidium iodide, and place them on ice for approximately five minutes.

تلطيخ خلايا نخاع عظم الفأر باستخدام Hoechst للكشف عن الخلايا السكانية الجانبية عن طريق قياس التدفق الخلوي

Flow Cytometry of Hoechst-Stained Mouse Bone Marrow Cells for Effective Detection of Side Population Using High-Power 375 nm and 405 nm Lasers

To begin, stain the murine bone marrow cells with Hoechst 33342. For flow cytometry, launch the required software, then select the QC standardization. Insert the quality control or QC FluoroSphere sample tube into the tube holder before selecting start to begin the QC procedure.To create a new experiment, click on New Experiment in the File menu and specify the file path and save the experiment. Then select Set Channel in the Settings menu. Select the channel signal checkbox, and add the reagent name in the label column.Next, click pseudo color plots icon in the plot area to create plots. Click add tube in the test tube screen to create new sample tubes and change their names. Then select Run to load the sample, view the plots and establish the gates.Adjust the gain and threshold settings and select Record to save the data. To design the gate setting logic, click the x-axis to select FSEW, and click the y-axis to select FSEA. Select Polygon Gate to draw gate A to circle the individual cell and exclude adherent cells.For the second plot, click the x-axis to select FSEA, and click the y-axis to select SSEA. Select Polygon Gate to draw gate B to separate non-fragmentary cells and exclude cellular debris. For the third plot, click the x-axis to select PIA, and click the y-axis to select SSEA.After drawing the gate B, select live cells exhibiting negative propidium iodide and draw gate C to obtain live cells. For the fourth two-dimensional plot, click the x-axis to select Hoechst Red, and click the y-axis to select Hoechst Blue. Right-click the plot and select Property from the dropdown menu.Select linear format for both the x-axis and y-axis and draw the gate for side population cells. Use the 355 nanometer and 405 nanometer lasers simultaneously to detect both the control cells and the experimental cells. Acquire fluorescent signals at the 690 by 50 and 450 by 50 nanometer channels corresponding to the two laser.Observe the effective stimulation of Hoechst 33342 dye with 355 and 405 nanometer lasers to visualize the clear side population cells. For the same samples, use the 375 nanometer and 405 nanometer lasers for cell detection. The 355 nanometer laser effectively excited the Hoechst 33342 dye, resulting in clear observation of SP cells of bone marrow.The SP cells of the same samples detected by the 355 nanometer laser and the 405 nanometer laser were found to be essentially identical. Both 375 nanometer and 405 nanometer lasers effectively excited Hoechst 33342 to obtain SP cells.