Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81800207) an J.H. unterstützt. Wir wissen die Unterstützung von Beckman Coulter, Inc. bei der Durchflusszytometrie und Parameterkalibrierung sehr zu schätzen. Wir danken Jiao Chen vom State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, und Yu Qi vom Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung in der Durchflusszytometrie.

Die Experimente in dieser Studie verwendeten insgesamt 10 C57BL/6-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sichuan University (#201609309) genehmigt wurde. Die experimentellen Materialien und die Parameter der Durchflusszytometrie, die in diesem Artikel verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Isolierung und Entnahme von Knochenmarkzellen der Maus
<ol><li>Euthanasieren Sie Mäuse in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. Um bei der Maus Bewusstlosigkeit hervorzurufen, verabreichen Sie Inhalationsanästhetika, beginnend mit 2% Isofluran, gefolgt von einer allmählichen Erhöhung der Dosierung auf 5% Isofluran bis zum Ende der Atmung.</li>
	<li>Sezieren Sie die Mäuse im Operationssaal oder im Abzug. Reinigen und sterilisieren Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut und den Muskel des Beins mit einer scharfen Schere vollständig ab und präparieren Sie die Oberschenkelknochen.</li>
	<li>Zerkleinern Sie den Oberschenkelknochen vorsichtig mit einem Mahlstab in einem Mörser und spülen Sie die Knochenmarkzellen mit DMEM-Medium aus, bis der Knochen weiß wird.</li>
	<li>Die gewonnenen Knochenmarkzellen werden mit einem 100 μm Filter in 15 mL Röhrchen filtriert. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Der Überstand wird verworfen und die verbleibenden roten Blutkörperchen werden 1 Minute lang bei 4 °C mit 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen lysiert. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Nach der Zentrifugation erneut mit DMEM-Medium waschen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL Inkubationslösung (DMEM-Medium + 5% FBS), zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,0 x 106 Zellen/ml mit Inkubationslösung ein.</li>
</ol>2. Zelluläre Färbung
<ol><li>Ergänzen Sie 2 ml Knochenmarkzellsuspension von jeder Maus mit 5 μg/ml Hoechst 33342. Zu einem weiteren 1 ml Aliquot fügen Sie 100 μM Verapamil als Negativkontrolle hinzu.</li>
	<li>In einem Wasserbad bei 37 °C für 90 min inkubieren und alle 30 min leicht umrühren.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Zellen 5 min auf Eis abkühlen lassen und anschließend bei 250 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in einer kaltfließenden Lösung (HBSS + 2% FBS). 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 500 μl laufender Lösung pro Probe. Vor der FCM-Analyse die Zellen mit 2 μg/ml Propidiumiodid (PI) ergänzen und ca. 5 Minuten auf Eis legen.</li>
</ol>3. Durchflusszytometrie
HINWEIS: Eine Übersicht über die verschiedenen verwendeten Systeme und Konfigurationen finden Sie in Tabelle 1.
<ol><li>Kalibrieren Sie die Werte des Variationskoeffizienten (CV) der erforderlichen Kanäle unter Verwendung der täglichen Qualitätskontrolle (QC) in den FCMs und führen Sie nach erfolgreichem Abschluss der Qualitätskontrolle Probentests durch.<ol><li>Wählen Sie die Desktop-Verknüpfung der Software aus und starten Sie die Software.</li>
		<li>Wählen Sie im Menü QC/Standardization die Option QC/Standardization starten , um auf das QC-Experiment zuzugreifen.</li>
		<li>Setzen Sie das QC-Fluorosphären-Probenröhrchen in den Röhrchenhalter ein.</li>
		<li>Wählen Sie Start aus, um das Beispiel zu laden und mit dem Ausführen der QC-Prozedur zu beginnen. FCMs sind nach dem QC-Durchlaufen einsatzbereit.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulieren Sie den Hoechst-Farbstoff 33342 derselben Proben mit einem 355-nm-, 375-nm- bzw. 405-nm-Laser für die Detektion von Hoechst-Rot im 690/50-nm-Kanal und von Hoechst-Blau im 450/50-nm-Kanal.<ol><li>Erstellen Sie ein neues Experiment, indem Sie im Menü Datei die Option Neues Experiment auswählen, den Dateipfad angeben und das Experiment speichern.</li>
		<li>Wählen Sie Kanal einstellen im Menü Einstellungen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Kanalsignal (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) und fügen Sie dann den Namen des Reagenzes in der Spalte Beschriftung hinzu (Y585: PI; V450: Hoechst Blau-405 nm; V660: Hoechst rot-405 nm; NUV450: Hoechst Blau-375 nm; NUV660: Hoechst Blau-375 nm; UV450: Hoechst Blau-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).</li>
		<li>Klicken Sie im Zeichnungsbereich auf die Symbole für Pseudofarbplots , um Plots zu erstellen. Wählen Sie einen Achsennamen aus, um zu ändern, welcher Kanal angezeigt wird.</li>
		<li>Klicken Sie im Bildschirm Reagenzglas auf Röhrchen hinzufügen , um neue Probenröhrchen zu erstellen und deren Namen zu ändern.</li>
		<li>Wählen Sie Ausführen aus, um die Stichprobe zu laden, die Diagramme anzuzeigen und die Gates festzulegen. Passen Sie die Verstärkungs- und Schwellenwerteinstellungen an. Wählen Sie Datensatz aus, um die Daten zu speichern.</li>
	</ol></li>
	<li>Entwerfen Sie die Logik der Gattereinstellung.<ol><li>Klicken Sie für das erste Diagramm auf die X-Achse , um FSC-W auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um FSC-A auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate A zu zeichnen, um die einzelne Zelle zu umkreisen und anhaftende Zellen auszuschließen (Abbildung 1A).</li>
		<li>Klicken Sie für das zweite Diagramm auf die X-Achse , um FSC-A auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um SSC-A auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate B zu zeichnen, um nicht-fragmentäre Zellen zu trennen und zelluläre Trümmer auszuschließen (Abbildung 1B).</li>
		<li>Klicken Sie für das dritte Diagramm auf die X-Achse , um PI-A auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um SSC-A auszuwählen. Wählen Sie das Polygon-Gatter aus, um Gate D zu zeichnen. Wählen Sie Live-Zellen mit negativem PI aus (Abbildung 1C), und ziehen Sie Gate C, um lebende Zellen zu erhalten.</li>
		<li>Klicken Sie für das vierte zweidimensionale Diagramm auf die X-Achse , um Hoechst Rot auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse , um Hoechst Blau auszuwählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm , und wählen Sie Eigenschaft aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie "Lineares Format" fürdie X-Achse und die Y-Achse. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate-SP zu zeichnen, um SP-Zellen abzurufen (Abbildung 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Zur Beurteilung der Eignung der Probe ist eine Auflösung von 355 nm eines spezifischen Durchflusszytometers23 für den Nachweis von SP-Zellen zu verwenden.</li>
	<li>Verwenden Sie die Laser 355 nm (Laserleistung: 20 mW) und 405 nm (Laserleistung: 80 mW) gleichzeitig, um sowohl die Kontrollzellen (mit Zusatz von Verapamil) als auch die experimentellen Zellen zu detektieren.</li>
	<li>Erfassen Sie Fluoreszenzsignale an den Kanälen 690/50 nm und 450/50 nm, die den beiden Lasern entsprechen. Beobachten Sie die effektive Stimulation des Farbstoffs Hoechst 33342 durch 355-nm- und 405-nm-Laser mit klaren SP-Zellen (Abbildung 2B-C).</li>
	<li>Verwenden Sie für die gleichen Proben die Laser 375 nm (Laserleistung: 60 mW) und 405 nm (Laserleistung: 80 mW) für die Zelldetektion.</li>
</ol>

Alternative Laseranregungsmethode zur einfachen Detektion von Populationszellen auf der Seite

<ol>
	<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies.">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li><li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1.">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells.">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li><li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential.">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li><li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity.">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li><li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+'side+population'.">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li><li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li><li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li><li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer.">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li><li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+stem+cells:+still+an+elusive+entity.">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64 (2017).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination.">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322 (2022).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties.">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178 (2021).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system.">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+PTEN/mTOR/STAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance.">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population.">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136 (2022).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway.">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538 (2021).</li><li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines.">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658 (2021).</li><li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform.">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Wir verwendeten das beschriebene Protokoll, um drei Experimente durchzuführen, wobei jeder Versuch 3-4 Mäuse umfasste, was zu insgesamt 10 Mäusen führte. Der Anteil der SP-Zellen lag zwischen 0,05 % und 0,76 %. Es ist wichtig zu beachten, dass bei den Mäusen individuelle Unterschiede beobachtet wurden. Wir setzten vier Durchflusszytometer ein, um die Hoechst-Proben zu analysieren. Es wird beobachtet, dass die Anregung des Hoechst-Farbstoffs durch einen 20 mW 355 nm Laser auf der neuen Version der Durchflusszytometri...

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Die SP-Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass der fluoreszierende DNA-Farbstoff durch ihren ATP-bindenden Kassettentransporter(ABC) 1,2 aus den Zellen gepumpt wird. Die Methode wurde ursprünglich für die Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) des murinen Knochenmarks etabliert1. Die Knochenmark-SP-Zellen wurden mit einer Population von HSCs angereichert, die durch eineniedrige CD117+Sca-1+Lin-Thy1-Expression gekennzeichnet waren 3,4. Danach wurde die Methode häufig verwendet, um Stammzellen aus anderen Geweben zu isolieren und anzureichern, darunter Herzmuskel5, Leber6, Lunge7, Niere8 und Vorderhirn9. Insbesondere wurde die Methode in den letzten zehn Jahren zur Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs) angewendet. CSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die die Eigenschaften der Tumorinitiierung, der Selbsterneuerung, der Resistenz gegen Chemotherapie und des Metastasierungspotenzials besitzen10. CSCs wurden zunächst bei hämatopoetischen Malignomen11 identifiziert und anschließend bei verschiedenen soliden Tumoren wie Prostata12, Eierstock13, Magen14, Brust15 und Lunge16 beobachtet. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Techniken zur CSC-Identifizierung bleibt die SP-Technik aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit in verschiedenen Geweben und Zelllinien eine bevorzugte Wahl. Darüber hinaus ist es eine wertvolle Technik zur Isolierung von CSCs mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)16,17,18. Die experimentellen Befunde zeigen, dass SP-Zellen eine ausgeprägte Tumorigenität aufweisen und erhöhte Expressionsniveaus von Stammzell-assoziierten Genen aufweisen19,20. Unsere vorherige Studie21 hat auch gezeigt, dass die transkriptomische Analyse isolierter SP-Zellen beim Multiplen Myelom eine Anreicherung von Signalwegen zeigt, die mit Stammzellen assoziiert sind, wie z. B. dem Hedgehog-Signalweg. In der Zwischenzeit führten wir Signalanreicherungsanalysen an den Genen durch, die in den SP-Zellen der akuten myeloischen Leukämie unterschiedlich exprimiert werden22. Die veränderten Gene wurden in stammzellbezogenen Signalwegen angereichert (Wnt/β-Catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch). Wir fanden heraus, dass 1 x 105 SP-Zellen Tumore in BALB/c-Null-Mäusen bilden konnten22, während Nicht-SP-Zellen dies nicht konnten, was darauf hindeutet, dass SP-Zellen Eigenschaften von Leukämie-Stammzellen aufwiesen. Die Wirksamkeit der Hoechst SP-Methode bei der Identifizierung von CSCs ist offensichtlich.
Das Hoechst SP-Protokoll wurde im Laufe der Forschung verfeinert und verbessert. Das Protokoll beinhaltet eine strenge Kontrolle der Farbstoffkonzentration, der Zelldichte, der Inkubationstemperatur und -dauer, der Pufferzusammensetzung und des pH-Wertes. Die nach diesem Protokoll vorbereiteten Zellproben wurden einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Aufgrund der Anregung des Hoechst-Farbstoffs mit einem UV-Laser bei 355 nm und der Detektion seiner Fluoreszenzemission sowohl mit einem 690/50 nm Filter (Hoechst Red) als auch mit einem 450/50 nm Filter (Hoechst Blue) ist für FCM ein 350 nm Laser erforderlich. 350-nm-Laser sind jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten in den meisten FCMs nicht üblich. Daher haben wir versucht, einen alternativen Ansatz zur Farbstoffanregung für den effektiven Nachweis von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu finden. In dieser Studie wurde die Fähigkeit der 375-nm- und 405-nm-Laser zur Detektion von SP-Zellen bewertet und mit der des 355-nm-Lasers verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen den SP-Zellen, die von den 355-nm-, 375-nm- und 405-nm-Lasern detektiert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm als praktikable Alternativen zu den 355 nm Lasern für die SP-Zelldetektion dienen können. Die Einbeziehung zusätzlicher Anregungslichtquellen für Hoechst 33342 ermöglicht die Verwendung weiterer Durchflusszytometrie-Modelle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>1M1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filter(100 &#181;m)</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CSS-013-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daily quality control fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10-013-CVRC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30030.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective detection of hoechst side population cells by flow cytometry

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Das Hoechst SP-Verfahren wird für die Isolierung von Stammzellen auf der Grundlage der Farbstoffausflusseigenschaften von ATP-bindenden Kassette (ABC)-Transportern eingesetzt. Die Methode wurde ursprünglich für die Identifizierung und Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) eingesetzt, hat sich aber weiterentwickelt und konzentriert sich nun hauptsächlich auf die Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs). Bei der traditionellen Detektionsmethode von FCM wird ein 355-nm-Laser verwendet, um den Farbstoff zum Nachweis von SP-Zellen anzuregen. Durch diese Studie ist es uns gelungen, alternative Ansätze zur Farbstoffanregung zu identifizieren, die die Detektion von SP-Zellen mit einem 355-nm-Laser effektiv ersetzen können. Dies wird durch den Einsatz von Hochleistungslasern mit 375 nm oder 405 nm erreicht. Dies ermöglicht es uns, eine verbesserte Selektivität bei der Detektion von SP-Zellen auszuüben, anstatt nur auf die 355-nm-Laser-Durchflusszytometrie beschränkt zu sein.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The SP cells are characterized by the pumping of the fluorescent DNA dye out of the cells through their ATP-binding cassette (ABC) transporter1,2. The method was originally established for isolating murine bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)1. The bone marrow SP cells were enriched with a population of HSCs characterized by &#160;CD117+Sca-1+Lin-Thy1low&#160;expression3,4. Thereafter, the method was widely used to isolate and enrich stem cells from other tissues, including cardiac muscle5, liver6, lung7, kidney8, and forebrain9. In particular, the method has been applied to isolate cancer stem cells (CSCs) in the past decade. CSCs represent a small population of cells that possess the properties of tumor initiation, self-renewal, resistance to chemotherapy, and metastatic potential10. CSCs were initially identified in hematopoietic malignancies11 and subsequently observed in various solid tumors such as the prostate12, ovarian13, gastric14, breast15, and lung16 carcinomas. Despite the availability of various techniques for CSC identification, the SP technique remains a favored choice owing to its broad applicability across diverse tissues and cell lines. Moreover, it is a valuable technique that isolates CSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS)16,17,18. The experimental findings demonstrate that SP cells exhibit pronounced tumorigenicity and display elevated expression levels of stem cell-associated genes19,20. Our previous study21 has also demonstrated that transcriptomic analysis of isolated SP cells in multiple myeloma reveals enrichment of signaling pathways associated with stem cells, such as the hedgehog pathway. Meanwhile, we performed pathway enrichment analyses on the genes differentially expressed in the SP cells of acute myelogenous leukemia22. The altered genes were enriched in stem cell-related pathways (Wnt/&#946;-catenin, TGF-&#946;, Hedgehog, Notch). We found that 1 x 105 SP cells could form tumors in BALB/c null mice22, whereas non-SP cells could not, indicating that SP cells had characteristics of leukemia stem cells. The efficacy of the Hoechst SP method in the identification of CSCs is evident.
The Hoechst SP protocol has been refined and enhanced through the progression of research. The protocol entails stringent control of the dye concentration, cell density, incubation temperature and duration, buffer composition, and pH value. The cell samples prepared in accordance with this protocol were subjected to flow cytometric analysis. Due to the excitation of Hoechst dye with a UV laser at 355 nm and detection of its fluorescence emission using both a 690/50 nm filter (Hoechst Red) and 450/50 nm filter (Hoechst Blue), a 350 nm laser is required for FCM. However, 350 nm lasers are not commonly equipped in most FCMs because of their high cost. Hence, we attempted to find an alternate approach for&#160;dye excitation for the effective detection of SP cells by flow cytometry. In this study, the capability of the 375 nm and 405 nm lasers in detecting SP cells was assessed and compared with that of the 355 nm laser. Our findings demonstrate a remarkable similarity between the SP cells detected by the 355 nm, 375 nm, and 405 nm lasers. These results suggest that the high-power 375 nm and 405 nm lasers can serve as feasible alternatives to the 355 nm laser for SP cell detection. The inclusion of additional excitation light sources for Hoechst 33342 facilitates the use of more flow cytometry models.

Autor im Rampenlicht: Innovative Lasertechniken für die Hoechst-Färbung zur Analyse von Zellen der Seitenpopulation

Effektiver Nachweis von Zellen der Hoechst-Seitenpopulation mittels Durchflusszytometrie

We use the Hoechst stain population method to detect tumor initiating cells. In this paper, we're trying to find alternative approaches for Hoechst excitation. We found that the high power 375 nanometer and 405 nanometer lasers can serve as feasible alternatives to the traditional 355 millimeter laser.Conventionally, the Hoechst dye is excited with a UV laser at 355 nanometer. Due to the high cost of the UV lasers, they're not commonly equipped in most flow cytometry models. Our protocol expands a range of the lasers that can be used to detect Hoechst staining.For researchers focusing on normal and malignant stem cells, more models of flow cytometry can be used to detect cytopopulation cells.

In Abbildung 2 wurde die Kontrollgruppe mit Verapamil behandelt, das ABC-Transporter in Stammzellen blockiert, um die Eliminierung von Hoechst 33342 zu verhindern. Dabei stoßen die Stammzellen der Nicht-Verapamil-Gruppe Hoechst 33342 aus und bilden eine negative Zellpopulation, die als SP-Zellen bezeichnet wird. Der 355-nm-Laser regte den Farbstoff Hoechst 33342 effektiv an, was zu einer klaren Beobachtung von SP-Zellen des Knochenmarks führte (Abbildung 2A). ...

Hier zeigen wir, dass Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm Laser Hoechst 33342 effektiv anregen und als praktikable Alternative zum 355 nm Laser für die Detektion von Seitenpopulationszellen (SP) dienen können, wodurch das Spektrum der verfügbaren Laser in der Durchflusszytometrie erweitert wird.

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

452 Aufrufe.  Sichuan University. Wir verwenden die Hoechst-Färbepopulationsmethode, um tumorinitiierende Zellen nachzuweisen. In dieser Arbeit versuchen wir, alternative Ansätze für die Hoechst-Anregung zu finden. Wir haben festgestellt, dass die Hochleistungslaser mit 375 Nanometern und 405 Nanometern als praktikable Alternativen zu den herkömmlichen 355-Millimeter-Lasern dienen können.Herkömmlicherweise wird der Hoechst-Farbstoff mit einem UV-Laser bei 355 Nanometern angeregt....

Serie: Autor im Rampenlicht: Innovative Lasertechniken für die Hoechst-Färbung zur Analyse von Zellen der Seitenpopulation

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized for the isolation of stem cells based on the dye efflux properties of ATP-binding cassette (ABC) transporters. The method was initially employed for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs), but it has now evolved to primarily focus on the identification and isolation of cancer stem cells (CSCs). The traditional detection method of FCM uses a 355 nm laser to excite the dye to detect SP cells. Through this study, we have successfully identified alternative approaches for dye excitation that can effectively replace the detection of SP cells using a 355 nm laser. This is achieved through the utilization of high-power 375 nm or 405 nm lasers. This allows us to exercise enhanced selectivity in the detection of SP cells rather than being solely limited to the 355 nm laser flow cytometry.

Here, we show that high-power 375 nm and 405 nm lasers can effectively excite Hoechst 33342 and serve as a viable alternative to the 355 nm laser for side population (SP) cell detection, thereby expanding the range of available lasers in flow cytometry applications.

Forschung

Krebsforschung

Staining Mouse Bone Marrow Cells with Hoechst to Detect Side Population Cells by Flow Cytometry

To begin, obtain bone marrow cells from the mouse and add five micrograms per milliliter Hoechst 33342 to two milliliters of cell suspension. Prepare the negative control tube as well. Incubate in a water bath at 37 degrees Celsius for 90 minutes with gentle agitation every 30 minutes After incubation, cool the cells on ice for five minutes, and then centrifuge at 250G for five minutes at four degrees Celsius.Resuspend the cells in a cold running solution containing Hank's Balanced Salt Solution with 2%FBS. Centrifuge again at four degrees Celsius for five minutes. Next, resuspend the resulting cell pellet in 500 microliters of running solution per sample.Prior to flow cytometry analysis, supplement cells with two micrograms per milliliter of propidium iodide, and place them on ice for approximately five minutes.

Färbung von Knochenmarkzellen der Maus mit Hoechst zum Nachweis von Zellen der Seitenpopulation mittels Durchflusszytometrie

Flow Cytometry of Hoechst-Stained Mouse Bone Marrow Cells for Effective Detection of Side Population Using High-Power 375 nm and 405 nm Lasers

To begin, stain the murine bone marrow cells with Hoechst 33342. For flow cytometry, launch the required software, then select the QC standardization. Insert the quality control or QC FluoroSphere sample tube into the tube holder before selecting start to begin the QC procedure.To create a new experiment, click on New Experiment in the File menu and specify the file path and save the experiment. Then select Set Channel in the Settings menu. Select the channel signal checkbox, and add the reagent name in the label column.Next, click pseudo color plots icon in the plot area to create plots. Click add tube in the test tube screen to create new sample tubes and change their names. Then select Run to load the sample, view the plots and establish the gates.Adjust the gain and threshold settings and select Record to save the data. To design the gate setting logic, click the x-axis to select FSEW, and click the y-axis to select FSEA. Select Polygon Gate to draw gate A to circle the individual cell and exclude adherent cells.For the second plot, click the x-axis to select FSEA, and click the y-axis to select SSEA. Select Polygon Gate to draw gate B to separate non-fragmentary cells and exclude cellular debris. For the third plot, click the x-axis to select PIA, and click the y-axis to select SSEA.After drawing the gate B, select live cells exhibiting negative propidium iodide and draw gate C to obtain live cells. For the fourth two-dimensional plot, click the x-axis to select Hoechst Red, and click the y-axis to select Hoechst Blue. Right-click the plot and select Property from the dropdown menu.Select linear format for both the x-axis and y-axis and draw the gate for side population cells. Use the 355 nanometer and 405 nanometer lasers simultaneously to detect both the control cells and the experimental cells. Acquire fluorescent signals at the 690 by 50 and 450 by 50 nanometer channels corresponding to the two laser.Observe the effective stimulation of Hoechst 33342 dye with 355 and 405 nanometer lasers to visualize the clear side population cells. For the same samples, use the 375 nanometer and 405 nanometer lasers for cell detection. The 355 nanometer laser effectively excited the Hoechst 33342 dye, resulting in clear observation of SP cells of bone marrow.The SP cells of the same samples detected by the 355 nanometer laser and the 405 nanometer laser were found to be essentially identical. Both 375 nanometer and 405 nanometer lasers effectively excited Hoechst 33342 to obtain SP cells.

Durchflusszytometrie von Hoechst-gefärbten Maus-Knochenmarkzellen zur effektiven Detektion von Seitenpopulationen mit Hochleistungslasern von 375 nm und 405 nm