قمنا بتطوير طريقة الفحص المجهري في الوقت الفعلي لقياس مصائد العدلات خارج الخلية أو NETs. تلعب هذه الشبكات دورا مهما في الدفاع المناعي الفطري. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن تراكم NETs في الأنسجة يساهم في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية.
بسبب الآثار المرضية ل NETs ، ارتفع الاهتمام بتطوير مضادات NETosis. لدراسة تثبيط NETosis ، قمنا بتطوير طريقة مجهرية في الوقت الفعلي لقياس إفراز NET البشري ، مما يسمح لنا بدراسة NETosis وتثبيطه بطريقة عالية الإنتاجية. العدلات هي خلايا حساسة ويمكنها تغيير استجابتها للمنبهات أثناء عملية التنقية بسبب الإجهاد الميكانيكي والميكروبي وأنواع أخرى من الإجهاد.
لذلك ، من المهم التحقق من صحة بروتوكول عزل العدلات لتقليل تنشيط العدلات. لذا فإن هذه التقنية تمكن من دراسة إطلاق NET من الأفراد الأصحاء وكذلك المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح لنا بدراسة حركية تكوين NET الناجم عن محفزات فسيولوجية مختلفة.
باستخدام تقنية الفحص المجهري عالية الإنتاجية هذه ، تمكنا من إثبات أن مضاد NETosis CIT-013 ، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة يستهدف الهيستونات 2A و 4 ، كان قادرا على تثبيط إطلاق NET بكفاءة باستخدام IC 50 أو 4.6 نانو ضرس. هذا يدل على أن هذا الاختبار مناسب لاختبار مضادات NETosis. بعد جمع الدم المحيطي من المتطوع السليم في أنبوب هيبارين الليثيوم ، انقل الدم إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا.
اشطف أنبوب الهيبارين الليثيوم باستخدام DPBS وانقله إلى نفس الأنبوب سعة 50 مليلتر ، مع التأكد من أن نسبة الدم إلى DPBS هي 1: 1. بعد الخلط ، أضف الدم المخفف فوق محلول تدرج الكثافة. قم بالطرد المركزي للدم عند 400 جم لمدة 40 دقيقة بأقل تسارع وكسر.
تخلص من طبقة البلازما العلوية بماصة سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية للتخلص من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ومحلول تدرج الكثافة. رج الطبقة التي تحتوي على كريات الدم الحمراء والعدلات برفق قبل إعادة تعليقها في 15 مل من DPBS.
أضف 25 مل من محلول كلوريد الصوديوم 6٪ و 0.9٪ من محلول كلوريد الصوديوم واخلطه عن طريق قلب الأنبوب. بعد 25 دقيقة من الحضانة ، انقل طبقة العدلات العلوية إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر مع ماصة سعة 10 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة 10 دقائق. صب الأنبوب للتخلص من المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من محلول تحلل البوتاسيوم بكلوريد الأمونيوم.
أضف 40 مل من نفس المخزن المؤقت للتحلل واحتضنه في درجة حرارة الغرفة مع عكس الأنبوب باستمرار حتى يصبح المحلول شفافا. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 350 جم لمدة 10 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، ببطء وبشكل متساقط ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة ، 10٪ فوق حبيبات العدلات دون تعليق العدلات.
قم بتدوير الأنبوب برفق حتى يتم إعادة تعليق معظم كريات الدم الحمراء الموجودة أعلى حبيبات العدلات في وسط الاستزراع. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات العدلات في 10 مل من وسط الثقافة ، 10٪ بمجرد إعادة تعليقها بالكامل ، أضف ما يصل إلى 50 مل من وسط الثقافة 10٪ وقم بالطرد المركزي للخليط قبل إعادة تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من مصيدة العدلات خارج الخلية أو المخزن المؤقت لمقايسة NET. للبدء ، أضف محلول 0.001٪ Poly-L-lysine إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئر واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
اغسل الآبار ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من DPBS وجفف الآبار بالهواء. بعد ذلك ، أعد تعليق العدد المطلوب من العدلات في مصيدة العدلات خارج الخلية أو المخزن المؤقت لفحص NET. انقل صبغة الحمض النووي المركزة أربع مرات في مخزن فحص NET إلى كل بئر.
أضف أربع مرات محفزات NETosis المركزة في المخزن المؤقت لفحص NET إلى الآبار المقابلة. بعد ذلك ، أضف مضادات NETosis المركزة أربع مرات في المخزن المؤقت لمقايسة NET وتعليق العدلات إلى الآبار المقابلة. الطرد المركزي للوحة عند 100 غرام لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، أدخل اللوحة في نظام تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية الموضوعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد وضع لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على تعليق العدلات في نظام تحليل المجهر للخلايا الحية ، افتح برنامج النظام. انقر فوق الجدول الزمني للحصول عليه وانقر فوق زر علامة الجمع لبدء التشغيل.
ثم حدد المسح الضوئي في الموعد المحدد وانقر فوق التالي. لإنشاء سفينة جديدة من البداية ، حدد جديد في قسم إنشاء سفينة وانقر فوق التالي. في المقطع نوع المسح الضوئي، حدد قياسي، ثم انقر فوق التالي.
حدد إعدادات المسح كخلية تلو الأخرى، لا شيء. قنوات الصورة ، تباين الطور باللون الأخضر. وقت الاستحواذ ، 100 مللي ثانية والهدف 20x.
ثم انقر فوق التالي. من قسم تحديد السفينة ، حدد نوع الوعاء المناسب لفحصه وانقر فوق التالي. حدد الموقع في الدرج للوعاء وانقر فوق التالي.
في قسم نمط المسح الضوئي ، حدد الآبار التي تحتاج إلى مسحها ضوئيا وعدد الصور لكل بئر. انقر فوق التالي. في قسم دفتر السفينة ، قم بتوفير معلومات حول السفينة.
أدخل اسم اللوحة وانقر فوق التالي. في المقطع إعداد التحليل، حدد تأجيل التحليل إلى وقت لاحق وانقر فوق التالي. في القسم جدول المسح، حدد إنشاء جدول جديد مع عمليات المسح الضوئي على فترات من، وحدد ساعة واحدة في القسم إضافة عمليات مسح ضوئي إلى الجدولة.
حدد إيقاف المسح الضوئي بعد خمس ساعات من الفحص الأول. انقر فوق التالي وانقر فوق إضافة للجدولة عندما تكون معلومات المسح الضوئي صحيحة. بعد الحصول على صور تباين الطور والتألق المناعي للعدلات ، قم بتشغيل برنامج تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية.
من طريقة العرض، حدد تجربة الفحص المجهري للخلايا الحية المراد تحليلها. حدد إنشاء تعريف تحليل جديد وانقر فوق التالي. ثم حدد المحلل الأساسي من قسم نوع التحليل وانقر فوق التالي.
في قسم قناة الصورة، حدد أخضر، وقم بإلغاء تحديد المرحلة، ثم انقر فوق التالي. افتح نافذة طبقات الصورة ، وحدد اللون الأخضر وقم بإلغاء تحديد المرحلة. قم بإيقاف تشغيل التحجيم التلقائي في القسم الأخضر وقم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى يدويا.
ثم افتح نافذة أوقات فحص السفينة وحدد الصور التي تمثل آبار التحكم الإيجابية باستخدام NETs. افتح نافذة إعدادات تعريف التحليل واكتب NETs لاسم الكائن. بالنسبة للتجزئة، حدد Adaptive.
بالنسبة للوحدة المرسومية للرسومات الرسومية للحد ، حدد بين ثلاثة وخمسة ، واضبط Edge Split On بين سالب 10 والصفر. بعد ذلك ، للتنظيف، حدد تعبئة الثقب إلى 100 ميكرومتر مربع واضبط الحجم على ناقص بكسل واحد. من المرشحات، حدد مساحة أكبر من 200 ميكرومتر مربع، ومتوسط الكثافة أقل من 24.6، والكثافة المتكاملة أكبر من 7,000.
ثم انقر فوق معاينة الحالية أو معاينة الكل لتطبيق الإعدادات. مرر مؤشر الماوس فوق هياكل NET المختلفة واضبط إعدادات التحليل لضبط NETs الإيجابية والسلبية الخاطئة. عندما تكون إعدادات تحليل NET صحيحة، انقر فوق التالي.
حدد النقاط الزمنية والآبار المراد تحليلها في قسم أوقات المسح والبئر وانقر فوق التالي. أدخل اسم التعريف في القسم حفظ وتطبيق تعريف التحليل وانقر فوق التالي. انقر فوق إنهاء عند التحقق من معلومات التحليل وصحتها.
افتح تحليل التجربة بالنقر فوق التحليل داخل الوعاء محل الاهتمام. ثم افتح نافذة مقاييس الرسم البياني. بعد ذلك ، انقر فوق زر علامة الجمع لإنشاء مقياس.
عند تقديم البيانات كنسبة مئوية من التقاء NET، حدد المنطقة في قسم المقياس وحدد التقاء في قسم القيمة. عند تقديم البيانات كنسبة مئوية من عدلات NETting ، حدد عدد الكائنات في قسم القياس وحدد لكل صورة في قسم القيمة. بعد تكوين إعدادات المقاييس، في قسم المقاييس المعرفة من قبل المستخدم، حدد NETs Area Confluence أو NETs Object Count لكل صورة.
حدد جميع النقاط الزمنية والآبار المطلوبة للتحليل من قسمي تحديد عمليات المسح وتحديد البئر على التوالي. أخيرا ، انقر فوق تصدير البيانات. أدى تحفيز أيونات الكالسيوم إلى حدوث NETosis بشكل أسرع مقارنة ب PMA ، مما أدى إلى ارتفاع نسبة العدلات التي تطلق NETs.
كانت NETs التي تسببها أيونات الكالسيوم أكثر انتشارا خارج غشاء البلازما العدلات ، بينما ظلت NETs التي يسببها PMA أقرب إلى غشاء بلازما العدلات. ولوحظ اتجاه نحو مستويات مرتفعة من النواتج الصافية عندما تم تنشيط العدلات بمجمعات مناعية مغلفة وبلورات FMLP وبلورات اليورات أحادية الصوديوم. تم تثبيط إطلاق NET استجابة ل 23187 تماما بواسطة CIT-013 بتركيز مثبط نصف أقصى يبلغ 4.6 نانومولار.
