يطور بحثنا نموذجا للأغشية الحيوية المجمعة في البلغم الاصطناعي لتكرار التهابات الرئة لدى مرضى التليف الكيسي. يسمح لنا هذا النموذج بتحليل تغيرات التعبير الجيني وفهم سبب زيادة مقاومة البكتيريا للعلاجات في هذه الظروف مقارنة ببيئات اختبار الأدوية القياسية. سلط تطوير نموذج غشاء حيوي معقد الضوء على تحديات تلخيص بيئة الرئة المعادية ، مما يجعل من الصعب التنبؤ بما إذا كانت التأثيرات المضادة للميكروبات في المختبر تتوافق مع النتائج في الجسم الحي.
تزيد الطبيعة الخاصة للمريض لالتهابات الرئة التليفية الكيسي من تعقيد تطوير نماذج معملية فعالة لاختبار مضادات الميكروبات. خلال هذا البحث ، نجحنا في إنشاء نموذج غشاء حيوي متعدد الميكروبات ، والذي يوفر منصة لاختبار مضادات الميكروبات في بيئة واقعية ، ويظهر مستوى المقاومة الذي يمكن ملاحظته في هذه الأغشية الحيوية ، ويسلط الضوء على إمكانية العلاجات المضادة للضراوة التي تستهدف مكونات مثل الجينات. إن وجود نموذج اختبار مضاد للميكروبات مصمم لتقليد بيئة رئة التليف الكيسي سيؤدي إلى سد الفجوة الموجودة بين الاختبار في الجسم الحي والاختبار في المختبر.
علاوة على ذلك ، فإن تقييم فيروس البكتيريا في بيئة تحاكي رئة التليف الكيسي بشكل وثيق سيسمح بتطوير واختبار العلاجات المضادة للضروعة. للبدء ، قم بربط حبة واحدة من pseudomonas aeruginosa PAO1 من مزارع مخزون الخرز المجمدة إلى مثقاب مرق lysogeny. احتضان الطبق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
لتحضير الأغشية الحيوية أحادية النوع ، قم بإعداد المزارع الليلية من pseudomonas aeruginosa PAO1 مع مستعمرة واحدة من صفيحة الخط واحتضانها طوال الليل لمدة 18 ساعة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة إلى كثافة بصرية تبلغ 0.05 عند 600 نانومتر ، أي ما يعادل 1 في 10 أس 8 وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف هذه الثقافة من 1 إلى 100 في وسط SCFM2.
بعد ذلك ، أضف 180 ميكرولترا من اللقاح إلى آبار صفيحة ميكروتيتر مستديرة القاع 96 بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية أثناء الرج بسرعة 75 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. قم بإحياء pseudomonas aeruginosa PAO1 والمكورات العنقودية الذهبية SH1000 من مزارع مخزون الخرز المجمدة كما هو موضح سابقا.
قم بإحياء المبيضات البيضاء CAF 2.1 كخط حبة واحدة على أجار سكر العنب سابورو ، واحتضان الألواح لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد مزارع المكورات العنقودية الذهبية والمبيضات البيضاء بين عشية وضحاها مع مستعمرات مفردة من صفائح الخط الخاصة بها في 5 مل من مرق الليسوجين. قم بتخفيف المزارع المعيارية لتشكيل لقاح واحد يحتوي على كلا النوعين بالتراكيز المطلوبة في SCFM2.
ثم أضف 162 ميكرولترا من اللقاح المختلط إلى آبار صفيحة ميكروتيتر 96 بئرا. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز بسرعة 75 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة للسماح بتكوين أغشية حيوية متعددة الأنواع. بعد ذلك ، أضف 14.2 ميكرولترا من الثقافة الليلية المحضرة للسودوموناس الزنجاري إلى آبار صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا ، واحتضان اللوحة مرة أخرى للسماح بتكوين الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات.
للبدء ، احصل على أغشية حيوية أحادية الأنواع ومتعددة الأنواع في ألواح ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا. لتعطيل الأغشية الحيوية ، أضف 8.81 ميكرولتر من مخزون DNase 1 مباشرة إلى الآبار التي تحتوي على الأغشية الحيوية ، مما يحقق تركيزا نهائيا يبلغ 50 ميكروغراما لكل ملليلتر. احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 75 دورة في الدقيقة.
احصل على محلول مخزون المضادات الحيوية من الميروبينيم بمعدل 2.56 ملليغرام لكل ملليلتر. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية بمعامل اثنين لتحقيق نطاق تركيز من 0.01 ملليغرام لكل مليلتر إلى 2.56 ملليغرام لكل ملليلتر. الآن ، أضف 20 ميكرولترا من كل تخفيف ميروبينيم إلى الأغشية الحيوية ، مما يحقق نطاقا من الجرعة من 1 ميكروغرام لكل مليلتر إلى 256 ميكروغرام لكل مليلتر.
أغلق صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا بغشاء شفاف ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع رجها 75 دورة في الدقيقة. لم تظهر الأغشية الحيوية الكاذبة أحادية النوع أي انخفاض كبير في الخلايا القابلة للحياة عند معالجتها بالميروبينيم بأي جرعة تصل إلى 256 ميكروغرام لكل مليلتر. كان استرداد Pseudomonas aeruginosa 0.74 log 10 وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر أعلى في بيئات النوع الفردي منه في البيئات متعددة الميكروبات بدون مضادات حيوية.
للبدء ، قم بإعداد الأغشية الحيوية أحادية الأنواع ومتعددة الأنواع لاستخراج الحمض النووي الريبي. بعد الحضانة ، انقل الأغشية الحيوية من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة مليلتر واحد يجمع الأغشية الحيوية المتكررة لكل عينة. الطرد المركزي الأنبوب عند 16 ، 000 جم لمدة خمس دقائق.
إذا تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي لاحقا ، فقم بإزالة المادة الطافية ، وقم بتخزين الحبيبات في 250 ميكرولتر من محلول تثبيت الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية. في وقت لاحق ، قم بإذابة الأنبوب بالحبيبات في درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي عند 16 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من كاشف TRIzol وقم بتعطيلها يدويا باستخدام إبرة 0.2 ملم متصلة بحقنة ملليلتر, الشفط 5 إلى 10 مرات, أو حتى تتعطل الحبيبات تماما.
اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتنقية الحمض النووي الريبي من الأغشية الحيوية المعطلة. لتحديد كمية الحمض النووي الريبي المنقى ، قم بإعداد محلول العمل ب 199 ميكرولتر من المخزن المؤقت وميكرولتر واحد من الكاشف لكل عينة. امزج 190 ميكرولترا من محلول العمل و 10 ميكرولتر من القياسي واحد والقياسي في أنابيب منفصلة.
ثم أضف 199 ميكرولترا من محلول العمل و 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي في أنابيب فردية. دوامة لمدة 30 ثانية ، وتخزينها في مكان مظلم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، على مقياس الفلور ، حدد الحمض النووي الريبي ، متبوعا ب Broad Range RNA ، واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
بعد أخذ القراءة الفارغة ، قم بإدخال ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي على حامل عينة مقياس الطيف الضوئي ، وقم بقياس الامتصاص عند 260 × 280 نانومتر. لتخليق الحمض النووي المجاني ، قم بإعداد مزيج التفاعل في الأنابيب. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج.
استخدم CDNA على الفور ، أو قم بتخزينه على حرارة 80 درجة مئوية. لم يختلف تعبير algD في الأغشية الحيوية الكاذبة الزنجارية أحادية النوع بشكل كبير عبر تركيزات ميروبينيم. في الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ، كان تعبير algD أعلى بكثير عند 256 ميكروغراما لكل مليلتر مما يشير إلى زيادة إنتاج الجينات في وجود كائنات استعمارية مشتركة.
