우리의 연구는 낭포성 섬유증 환자의 폐 감염을 복제하기 위해 인공 객담에서 응집체 생물막 모델을 개발합니다. 이 모델을 통해 유전자 발현 변화를 분석하고 표준 약물 검사 환경에 비해 이러한 조건에서 박테리아가 치료제에 더 내성이 생기는 이유를 이해할 수 있습니다. 복잡한 생물막 모델을 개발하면서 적대적인 폐 환경을 재현하는 데 따른 어려움이 부각되었으며, 이로 인해 체외 항균 효과가 in vivo 결과와 일치하는지 예측하기가 어려웠습니다.
낭포성 섬유증 폐 감염의 환자 특이적 특성은 항생제 검사를 위한 효과적인 실험실 모델의 개발을 더욱 복잡하게 만듭니다. 이 연구를 통해 우리는 현실적인 환경에서 항균제를 테스트할 수 있는 플랫폼을 제공하고, 이러한 생물막에서 관찰할 수 있는 내성 수준을 보여주며, 알긴산과 같은 성분을 표적으로 하는 항독성 요법의 잠재력을 강조하는 다미생물 응집체 생물막 모델을 성공적으로 만들었습니다. 낭포성 섬유증 폐 환경을 모방하도록 설계된 항균 테스트 모델을 보유하면 in vivo 테스트와 in vitro 테스트 사이에 존재하는 격차를 해소할 수 있습니다.
또한, CF 폐를 더 밀접하게 모방한 환경에서 박테리아의 바이러스를 평가하면 항독성 치료제의 개발 및 테스트가 가능할 것입니다. 먼저 냉동 비드 스톡 배양액에서 추출한 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) PAO1 단일 비드를 용원 배지 오거에 줄무늬를 만듭니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
단일 종 생물막 준비를 위해 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니로 Pseudomonas aeruginosa PAO1의 야간 배양을 준비하고 18시간 동안 밤새 배양합니다. 그런 다음 배양물을 600 나노 미터에서 0.05의 광학 밀도로 희석하며, 이는 밀리리터당 8 콜로니 형성 단위의 10 곱하기 값에 해당합니다. 또한, 이 배양물을 SCFM2 배지에 1 내지 100으로 희석한다.
다음으로, 바닥이 둥근 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 180마이크로리터의 접종물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하면서 24시간 동안 분당 75회전으로 흔듭니다. 앞서 설명한 바와 같이 냉동 비드 스톡 배양에서 녹농균 PAO1 및 황색포도상구균 SH1000을 되살립니다.
칸디다 알비칸 CAF 2.1을 sabouraud 포도당 한천에 단일 비드 줄무늬로 되살리고 섭씨 37도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 칸디다 알비칸스(candida albicans)의 하룻밤 배양을 5ml의 용원 육수에 각각 줄무늬 플레이트의 단일 콜로니로 준비합니다. 표준화된 배양액을 희석하여 SCFM2에서 필요한 농도로 두 종을 모두 포함하는 단일 접종물을 형성합니다.
그런 다음 162마이크로리터의 혼합 접종물을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하면서 24시간 동안 분당 75회전으로 흔들어 다종 생물막을 형성할 수 있습니다. 다음으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 준비된 익일 배양 14.2마이크로리터를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하고 플레이트를 다시 배양하여 다미생물 생물막을 형성할 수 있도록 합니다.
시작하려면 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 단일 종 및 다중 종 생물막을 얻습니다. 생물막을 파괴하기 위해 8.81마이크로리터의 DNase 1 스톡을 생물막이 포함된 웰에 직접 첨가하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 달성합니다. 접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하면서 분당 75회전으로 흔듭니다.
밀리리터당 2.56mg의 메로페넴 항생제 원액을 얻습니다. 2배로 연속 희석을 수행하여 밀리리터당 0.01mg에서 밀리리터당 2.56mg의 농도 범위를 달성합니다. 이제 각 미로페넴 희석액 20마이크로리터를 생물막에 첨가하여 밀리리터당 1마이크로그램에서 밀리리터당 256마이크로그램의 투여 범위를 달성합니다.
96웰 마이크로타이터 플레이트를 투명 필름으로 밀봉하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하면서 분당 75회전으로 흔듭니다. 단일 종 슈도모나스 생물막은 밀리리터당 최대 256마이크로그램의 용량으로 메로페넴으로 처리했을 때 생존 가능한 세포의 현저한 감소를 보여주지 않았습니다. 녹농균의 회수율은 밀리리터당 0.74 log 10 콜로니 형성 단위가 더 높았으며, 항생제가 없는 다미생물 환경보다 단일 종 환경에서 더 높았습니다.
먼저 RNA 추출을 위해 단일 종 및 다중 종 생물막을 준비합니다. 배양 후 각 웰의 생물막을 1mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 각 샘플에 대한 생물막 복제를 풀링합니다. 튜브를 16, 000G에서 5분 동안 원심분리합니다.
나중에 RNA 추출을 수행하는 경우 상등액을 제거하고 펠릿을 섭씨 80도에서 250마이크로리터의 RNA 안정화 용액에 보관하십시오. 나중에, 실온에서 펠릿으로 튜브를 해동하고 16, 000G에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 600마이크로리터의 TRIzol 시약에 재현탁시키고 2밀리리터 주사기에 부착된 0.2mm 바늘을 사용하여 5-10회 흡입하거나 펠릿이 완전히 파괴될 때까지 수동으로 파괴합니다.
파괴된 생물막에서 RNA를 정제하기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오. 정제된 RNA를 정량화하려면 각 샘플에 대해 199마이크로리터의 버퍼와 1마이크로리터의 시약으로 작업 용액을 준비합니다. 190마이크로리터의 작업 용액과 10마이크로리터의 표준 1 및 표준 2를 별도의 튜브에 혼합합니다.
그런 다음 199마이크로리터의 작업 용액과 1마이크로리터의 RNA 샘플을 개별 튜브에 추가합니다. 30초 동안 소용돌이치고 5분 동안 어두운 곳에 보관하십시오. 그런 다음 형광계에서 RNA를 선택한 다음 Broad Range RNA를 선택하고 화면의 지시를 따릅니다.
블랭크 판독값을 취한 후 분광광도계의 샘플 홀더에 1마이크로리터의 RNA를 피펫팅하고 260 x 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 무료 DNA 합성을 위해 튜브에서 반응 혼합물을 준비합니다. 튜브를 열 순환기에 넣고 프로그램을 실행합니다.
CDNA를 즉시 사용하거나 섭씨 80도에서 보관하십시오. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 생물막에서 algD 발현은 메로페넴 농도에 따라 크게 다르지 않았습니다. 다미생물 생물막에서 algD 발현은 밀리리터당 256마이크로그램으로 상당히 높았으며, 이는 공동 집락화 유기체가 존재할 때 알긴산 생산이 증가했음을 나타냅니다.
