يوفر بحثنا دليلا مفيدا لدراسة التفاعل الكيميائي الحيوي بين البكتيريا الدقيقة السلية وأجهزة الاستشعار الميكروبية التي تعبر عن الميكروفاج البشري وستكون ذات صلة بالجزيئات الأكثر صلابة التي تلعب دورا في دخول البكتيريا الدقيقة السلية إلى الخلايا الليفية. تمت دراسة تفاعل المستقبلات على مر السنين باستخدام الأساليب التي تستخدم عادة استخدام آلات المراسل ، والجزيئات المحكم ، والبروتينات المؤتلفة المستوية ، والضربة القاضية ، والضربة القاضية ، ونماذج التعبير المنخفض. يمكن أن تكون هذه التقنيات صعبة وتتطلب وقتا طويلا ومكلفة في بعض الأحيان.
باستخدام البروتوكول المنشور ، نظهر ، لأول مرة ، أنه في البلاعم ، يتفاعل مستقبلات SLMF1 مع المتفطرة السلية ، مما يعزز امتصاص البكتيريا ويؤدي إلى النضج البطاني الثنائي. لقد تغلبنا على الصعوبات المرتبطة بتجارب التعبير الجيني ووصفنا هدفا جديدا للاستراتيجيات العلاجية الجديدة. يقدم بروتوكولنا بديلين للكشف عن التفاعل الكيميائي الحيوي بين البكتيريا الدقيقة السلية والمستشعر الميكروبي SLMF1 باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري ، وهما تقنيتان متاحتان عادة ومستخدمتان بشكل مثمر.
هذه المنهجية لها العديد من الاستخدامات المحتملة ويمكن تكييفها بسهولة في سياقات البحث الأخرى. نحن نقدم بروتوكولا بسيطا يقيم تفاعل مستقبلات المتفطرة السلية باستخدام البكتيريا المعطلة والصوتنة للخلية بأكملها ، والتي يمكن إجراؤها في ظل ظروف BSL2 ، ولكن يمكن تكييفها بسهولة مع المستقبلات الأخرى والسلالات الحية. إذا لزم الأمر ، يمكن أيضا إجراء هذه المقايسات في ظل ظروف BSL3 مع مسببات الأمراض الحية المختلفة.
للبدء ، قم بنقل الدم الذي تم جمعه بعناية من المتبرعين الأصحاء إلى أنابيب سعة 50 مليلتر وتخفيفه إلى نصف حجمه بالمحلول الملحي. قم بإعداد وسط تدرج الكثافة وقم بالطرد المركزي للعينة لفصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، PBMCs. اجمع PBMCs من الهالة البيضاء.
بعد عد الخلايا في غرفة عد الخلايا ، قم بإجراء الاختيار المغناطيسي باستخدام حبات CD14 لجمع الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14. ثم أعد تعليق الخلايا المعزولة في وسط RPMI 1640. بذرة 500 ميكرولتر من الخلايا الوحيدة الإيجابية CD14 بتركيز واحد في 10 إلى قوة ست خلايا لكل مليلتر في كل بئر من صفيحة زراعة خلايا 24 جيدا في غياب المصل لتعزيز الالتصاق.
بعد ساعتين ، اغسل الآبار بوسط RPMI 1640 الدافئ مسبقا لإزالة الخلايا غير الملتصقة. قم بتمييز الخلايا الوحيدة إلى ضامة باستخدام مليلتر واحد من وسط RPMI 1640 الكامل لمدة 16 إلى 18 ساعة. في اليوم التالي ، اغسل الآبار بمليلتر واحد من PBS وأضف ملليلترا واحدا من وسائط RPMI 1640 الكاملة إلى كل بئر.
تحفيز البلاعم ب 10 ميكرولتر من مستضدات المتفطرة السلية الصوتية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، باستخدام ماصة P-1000 ، تخلص من وسط RPMI الكامل من آبار اللوحة. أضف PBS البارد والماصة لأعلى ولأسفل لحصاد البلاعم.
نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب عند 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي الإضافي.
احتضن التعليق على الجليد لمدة ساعة واحدة ، مع الدوران كل 10 دقائق. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 14 ، 000G لمدة 15 دقيقة وجمع المادة الطافية. احتضان مرة واحدة في 10 لقوة ست خلايا متفطرة السلية المعطلة بالكامل مع 50 ميكرولتر من مستخلص البروتين من واحد في 10 إلى قوة ستة بلاعم بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في حامل أنبوب دقيق دوار.
في اليوم التالي ، لتلطيخ مركب البكتيريا البروتينية ، أضف الجسم المضاد SLAMF1 المضاد للإنسان إلى الأنبوب الدقيق ، وقم بدوامة الخليط ، واحتضانه طوال الليل لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام. بعد غسل مجمعات البكتيريا البروتينية باستخدام FACS ، أعد تعليقها في عازلة FACS واحصل على العينة على مقياس التدفق الخلوي. باستخدام ملاقط جراحية مستديرة الأنف ، ضع غطاء دائري مقاس 12 ملم في آبار صفيحة ثقافة 24 بئرا.
احتضان زلة الغطاء بمستضدات المتفطرة السلية الرودامين لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من مستخلص البروتين المخفف في 300 ميكرولتر من PBS واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض. لف غطاء لوحة الثقافة بغشاء البارافين.
أضف قطرة 60 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المضاد ل SLAMF1 الذي تم معايرته مسبقا على الغطاء المغطى بغشاء البارافين. قم بإزالة زلة الغطاء بعناية من اللوحة باستخدام ملاقط وإبر جراحية ذات طرف رفيع منحني. بعد الحضانة بمحلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، قم بإزالة السائل الزائد وقم بتركيب زلة الغطاء على قطرة من سائل التثبيت الموضوعة على شريحة زجاجية.
ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري وراقب الخلايا باستخدام المرشحات المناسبة. تم عزل الخلايا الوحيدة بنجاح من PBMCs بنقاء 95٪ أو أكثر ، وتم إنشاء الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة بعد الالتزام والثقافة بين عشية وضحاها. تم تحفيز التعبير السطحي SLAMF1 في البلاعم المحفزة بمستضدات المتفطرة السلية ، وتم تأكيد مستوياتها باستخدام قياس التدفق الخلوي.
تم إثبات التفاعل بين SLAMF1 والخلايا الكاملة لبكتيريا السل الفطرية باستخدام مقايسة الربط المتقاطع متبوعا بقياس التدفق الخلوي. تم تصور التفاعل بين مستضدات SLAMF1 والمتفطرة السلية باستخدام الفحص المجهري الفلوري مع التوطين المشترك الذي أكدته الصور المدمجة.
