Nossa pesquisa fornece um guia útil para estudar a interação bioquímica entre microbacterium tuberculosis e sensores microbianos que expressam micrófagos humanos e será relevante para as moléculas mais rígidas que desempenham um papel na entrada de microbacterium tuberculosis nos fibrócitos. A interação do receptor tem sido estudada ao longo dos anos usando abordagens que geralmente empregam o uso de máquinas repórteres, moléculas herméticas, proteínas recombinantes niveladas, knockout, knockdown, modelos de menor expressão. Essas técnicas podem ser desafiadoras, demoradas e, às vezes, caras.
Usando o protocolo publicado, mostramos, pela primeira vez, que em macrófagos, o receptor SLMF1 interage com mycobacterium tuberculosis, promovendo a captação bacteriana e levando à maturação endolisossômica. Superamos as dificuldades associadas aos experimentos de expressão gênica e descrevemos um novo alvo para novas estratégias terapêuticas. Nosso protocolo oferece duas alternativas para detectar a interação bioquímica entre a microbactéria tuberculosis e o sensor microbiano SLMF1 usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência, duas técnicas geralmente disponíveis e frutíferas.
Esta metodologia tem muitos usos potenciais e pode ser facilmente adaptada em outros contextos de pesquisa. Fornecemos um protocolo simples que avalia a interação do receptor do mycobacterium tuberculosis usando bactérias inativadas e sonicadas de células inteiras, que pode ser realizado na condição BSL2, mas facilmente adaptado a outros receptores e cepas vivas. Se necessário, esses ensaios também podem ser realizados em condições BSL3 com diferentes patógenos vivos.
Para começar, transfira cuidadosamente o sangue coletado de doadores saudáveis para tubos de 50 mililitros e dilua-o até a metade de seu volume com solução salina. Preparar um meio de gradiente de densidade e centrifugar a amostra para separar as células mononucleares do sangue periférico, PBMC. Recolher as PBMCs do halo esbranquiçado.
Depois de contar as células em uma câmara de contagem de células, realize a seleção magnética com grânulos CD14 para coletar os monócitos CD14 positivos. Em seguida, ressuspenda as células isoladas no meio RPMI 1640. Semear 500 microlitros de monócitos CD14 positivos a uma concentração de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro em cada poço de uma placa de cultura de células de 24 poços na ausência de soro para promover a adesão.
Após duas horas, lave os poços com meio RPMI 1640 pré-aquecido para remover as células não aderentes. Diferencie os monócitos em macrófagos usando um mililitro de meio RPMI 1640 completo por 16 a 18 horas. No dia seguinte, lave os poços com um mililitro de PBS e adicione um mililitro de mídia RPMI 1640 completa a cada poço.
Estimular os macrófagos com 10 microlitros de antígenos sonicados do Mycobacterium tuberculosis por 24 horas. No dia seguinte, usando uma pipeta P-1000, descarte o meio RPMI completo dos poços da placa. Adicione PBS frio e pipete para cima e para baixo para colher os macrófagos.
Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento num tampão de ensaio de radioimunoprecipitação suplementado.
Incube a suspensão no gelo por uma hora, agitando a cada 10 minutos. Centrifugar a suspensão a 14 000 g durante 15 minutos e recolher o sobrenadante. Incubar uma vez 10 elevado a seis células inteiras inativadas de mycobacterium tuberculosis com 50 microlitros de extrato proteico de um vezes 10 elevado a seis macrófagos durante a noite a quatro graus Celsius em um suporte de microtubo rotativo.
No dia seguinte, para manchar o complexo de bactérias proteicas, adicione o anticorpo anti-SLAMF1 humano ao microtubo, vortex a mistura e incube durante a noite por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Depois de lavar os complexos de bactérias proteicas com FACS, ressuspendê-los em tampão FACS e adquirir a amostra em um citômetro de fluxo. Usando uma pinça cirúrgica de ponta redonda, coloque lamínulas redondas de 12 milímetros nos poços de uma placa de cultura de 24 poços.
Incubar a lamínula com antígenos de rodamina do Mycobacterium tuberculosis por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione 100 microlitros de extrato proteico diluído em 300 microlitros de PBS e incube por duas horas em temperatura ambiente com agitação. Enrole a tampa da placa de cultura com filme de parafina.
Adicione uma gota de 60 microlitros de anticorpo primário anti-SLAMF1 previamente titulado na tampa coberta com filme de parafina. Remova cuidadosamente a lamínula da placa usando pinças cirúrgicas e agulhas de ponta fina curva. Após a incubação com solução de anticorpos primário e secundário, remova o excesso de líquido e monte a lamínula em uma gota de líquido de montagem colocada em uma lâmina de vidro.
Coloque a lâmina sob um microscópio de fluorescência e observe as células usando filtros apropriados. Os monócitos foram isolados com sucesso de PBMCs com pureza de 95% ou mais, e macrófagos derivados de monócitos foram gerados após adesão e cultura durante a noite. A expressão superficial de SLAMF1 foi induzida em macrófagos estimulados com antígenos do Mycobacterium tuberculosis, e seus níveis foram confirmados por citometria de fluxo.
A interação entre SLAMF1 e células inteiras de mycobacterium tuberculosis foi demonstrada usando um ensaio de reticulação seguido de citometria de fluxo. A interação entre os antígenos SLAMF1 e Mycobacterium tuberculosis foi visualizada por microscopia de fluorescência com co-localização confirmada por imagens mescladas.
