يركز بحثنا على عدوى المكورات العنقودية الذهبية بهدف إنشاء نموذج عدوى بين الخلايا. سيوفر هذا النموذج رؤى قيمة حول الآلية الكامنة وراء العدوى بين الخلايا ويساهم في تطوير سن صارمة للوقاية منها وعلاجها. أحدث تقدم في عدوى المكورات العنقودية الذهبية داخل الخلايا هو دراسة آلية العدوى لتنظيم بقاء البكتيريا وانتشارها داخل الخلية ، وسيضيف إلى تحسين الدواء والتعديل الهيكلي لتحسين التأثير العلاجي.
يستخدم هذا المجال البحثي زراعة الخلايا ، وتقنية التسلسل الخلوي الناشئة ، والحرارة الأكسجين عالية الوقود ، وتكنولوجيا تحرير الجينات ، وغيرها من التقنيات ذات الصلة لدراسة عدوى البكتيريا في الخلايا. على عكس نماذج العدوى التقليدية ، قمنا بتحسين الظروف التجريبية الخاصة بالعدوى داخل الخلايا. بعد إصابة الخلايا بالمكورات العنقودية الذهبية بشكل فردي ، يتم بعد ذلك تلقيح الخلايا المصابة بالبكتيريا في الفئران لإنشاء عدوى داخل الخلايا.
يعمل هذا النهج على تحسين الكفاءة عن طريق تقليل تداخل البكتيريا الحرة ، مما يضمن الاحتفاظ بعملية العدوى داخل الخلايا بشكل أكثر دقة. ستركز طريقتنا على تطوير أدوية الأجسام المضادة والتقدم للوقاية من الالتهابات البكتيرية وعلاجها في المستقبل. لتحضير مرق نشا 6٪ ، أضف مسحوق مستخلص اللحم البقري والتربتون وكلوريد الصوديوم إلى وعاء زجاجي على التوالي بنسبة كتلة من 3 إلى 10 إلى 5.
أضف 100 مل من الماء المقطر المزدوج وحركه لإذابة المكونات. سخني المحلول في الميكروويف. ثم أضيفي النشا القابل للذوبان بنسبة كتلة 6 وحركي الخليط حتى يذوب تماما.
قم بتعقيم المرق على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد تعقيمه ، قم بتخزين المرق على أربع درجات مئوية حتى يتكون عجينة. لجمع البلاعم البريتونية للفأر ، باستخدام اليد اليسرى ، أمسك عنق الماوس وتحكم في ذيله.
ثم اقلب الماوس بحيث يتم وضع رأسه لأسفل ويكون بطنه متجها لأعلى. قم بإعطاء حقن داخل الصفاق بسعة ثلاثة ملليلتر من مرق النشا بنسبة 6٪ في الفأر. بعد 72 ساعة من الحقن ، قم بالتضحية بالفأر المخدر وتطهيره بالكحول الإيثيلي بنسبة 75٪.
باستخدام مقص العيون ، افتح بطن الفأر لكشف الصفاق بالكامل. حقن 10 ملليلتر من DMEM في تجويف البطن من خلال الحقن داخل الصفاق. افركي البطن برفق لمدة دقيقة واحدة لغسل التجويف.
بعد ذلك ، استخدم حقنة لتجميع السائل المغسول في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. قم بالطرد المركزي لسائل الغسيل عند 300 جم لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS والبنسلين والستربتومايسين.
خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية وأضفه إلى عداد الخلايا لحساب الخلايا. تمييع الخلايا إلى تركيز 2 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل مليلتر باستخدام DMEM FBS. لوحة واحدة مليلتر من تعليق الخلية لكل بئر على لوحة ستة آبار.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المعقم وزرعها طوال الليل باستخدام مليلتر واحد من DMEM لكل بئر في نفس الظروف.
احتضان البلاعم البريتونية باستخدام المكورات العنقودية الذهبية MRSA-252 لمدة ساعتين. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. أضف مليلتر واحد لكل بئر من وسط DMEM الكامل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. باستخدام مكشطة الخلية ، اجمع البلاعم البريتونية في أنابيب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. الطرد المركزي للعينات عند 1000 غرام لمدة خمس دقائق.
أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الليزوزيم إلى البلاعم المصابة ب MRSA-252 داخل الخلايا ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، أعد تعليقها في ملليلتر واحد من PBS. بعد ذلك ، أخرج حوالي 20 ميكرولترا من aliquot وأضف 0.1٪ Triton X-100 لمدة خمس دقائق لتحلل الخلايا.
قم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية لتعليق الخلية المحللة باستخدام PBS وإسقاطها على لوحة مثقاب الصويا التريبتي. احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، عد المستعمرات البكتيرية لحساب بكتيريا MRSA-252 داخل الخلايا في الضامة الصفاقية.
ضع الماوس تحت مصباح العلاج الطبيعي بالأشعة تحت الحمراء حتى يتسع وريد الذيل. قسم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات. حقن عن طريق الوريد 3 مرات 10 إلى قوة 6 CFU العوالق MRSA-252 في الوريد الذيل للفأر.
بعد 24 ساعة ، ضحي بالفأر المخدر وقم بتطهيره جيدا بالكحول الإيثيلي بنسبة 75٪. استخدم الملقط بيد واحدة لرفع جلد البطن وباليد الأخرى قم بقص الجلد باستخدام مقص العيون. حدد موقع الكلى في تجويف البطن وقم بتجريدها بعناية تماما.
انقل الكلى إلى أنبوب طحن يحتوي على مليلتر واحد من PBS ، وطحنها حتى لا يتبقى أي نسيج صلب. صب الأنسجة المتجانسة في أنبوب Eppendorf. إجراء التخفيفات التسلسلية لتجانس الأنسجة باستخدام PBS.
ضع كل مخفف على ألواح مثقاب فول الصويا الثلاثية المنفصلة واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات البكتيرية في اليوم التالي وحلل البيانات. تم إنشاء نماذج العدوى داخل الخلايا للمكورات العنقودية الذهبية بنجاح في ظل ظروف البلعمة المحسنة والعلاج الممتد بالمضادات الحيوية مع بقاء بعض البكتيريا داخل الضامة.
احتفظت البلاعم المصابة بالمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين بالبكتيريا داخل الخلايا بعد ساعتين من العلاج بالمضادات الحيوية عندما لم يعد المادة الطافية تحتوي على بكتيريا. في الجسم الحي ، أظهرت فحوصات الاستعمار البكتيري في الفئران أن الفانكومايسين قضى على المكورات العنقودية الذهبية خارج الخلية ، لكنها فشلت في إزالة البكتيريا داخل الخلايا.
