كان مدعوما من قبل المنح البحثية والمعاهد الوطنية للصحة EY012031 EY0182175 ومؤسسة كيربي FM.

ملاقط بصرية لمعالجة الخلايا المعزولة في الثقافة تتولد من محاصرة القوات ملاقط بصرية من الزخم للضوء (Ashkin ، 1991 ؛. Ashkin وآخرون ، 1986). على الرغم من أن هذه القوات الفخ بسهولة الخلايا في التعليق ، فهي ليست قادرة على نقل الخلايا التي تلتزم السطح. لذلك ، للحد من الالتصاق على طبق الثقافة في النقطة التي يتم فيها محاصرة الخلايا ، ساترة المغلفة مع البولي - 2 - hydroxyethylmethacrylate (بولي هيما) (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) مركب ، غير سامة مع الخلية طارد الخصائص المستخدمة سابقا للدراسات على التصاق الخلايا البطانية (فوكمان وموسكونا ، 1978). بينما بولي HEMA يغطي نصف الطبق الثقافة ، وهي مغلفة والنصف الآخر مع الركيزة التي تدعم نمو الخلايا. في المختبر لدينا ، يتم استخدام سال (1) بوصفها الركيزة للخلايا السمندل زراعة الشبكية. الإجراء لافتعال سال (1) ويوصف بولي HEMA الأطباق المغلفة أدناه : تصنيع الأطباق الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverglasses نظيفة (# 1 VWR العلمية المحدودة ، وسائل الإعلام ، والسلطة الفلسطينية) في حامض. وقد تم اختيار هذا ساترة لسمك لها ل0.1mm للتو ، ضرورية لأهداف الفتحة العددية العالية المطلوبة لتركيز الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء منطقة طارد الخلية ، ويحل 20 ملغ بولي هيما (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) في 1ml من الايثانول 95 ٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. يفضل ، ينبغي استخدام هذا الحل في حدود 1 في الشهر من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دعم لموقف coverglasses في رأسي قرب في بيئة خالية من الغبار مثل غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد أو قطرتين من محلول بولي HEMA قرب أعلى ساترة من غيض من البلاستيك micropipette 200μl. ينبغي أن يقتصر قطرات (حوالى 50 100μl لكل منهما) لنصف ساترة. المنحدر الحاد يضمن السائل يتدفق على سطح ساترة إلى أسفل ، وتوفير طلاء رقيقة حتى بولي HEMA. السماح للcoverglasses بولي HEMA المغلفة ليجف في غطاء محرك السيارة عن 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الجانب بولي HEMA من ساترة بالقلم غيض غرامة على مقربة من الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ثقب 1 سم في الجزء السفلي من صحن الثقافة 35 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة الغراء بولي HEMA المغلفة لقاع الطبق الثقافة مع Sylgard 184 (داو كورننغ شركة ميدلاند ، ميتشيغن) بحيث الجانب بولي HEMA المغلفة يواجه نحو الداخل من صحن. ضمان حافة طلاء بولي HEMA يمتد الى اسفل وسط حفرة. السماح للأطباق لتجف لمدة 1-3 أيام في درجة حرارة الغرفة في بيئة خالية من الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط الصفر على السطح الخارجي للساترة بالقلم الماس الحافة التالية حافة طلاء بولي HEMA. ثم ، لا شيء خطين العبور في زوايا الحق في ذلك حوالي 2mm وعدا. نقطتي تقاطع بمثابة مرجع أو نقاط إيمانية ليتم استخدامها لاستنساخ نفس اتجاه الطبق الثقافة على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأطباق تحت الضوء فوق البنفسجي بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء خلية نصف ملتصق من صحن والثقافة ، ومعطف غير بولي HEMA نصف مع سال - 1 ، الذي يحتوي على الماوس المضادة للأجسام المضادة التي أثيرت ضد السمندل أغشية الخلايا الشبكية (المقدمة بسخاء من قبل الدكتور بيتر MacLeish ، مورهاوس في كلية الطب واتلانتا ، جورجيا ، وانظر MacLeish وآخرون (1983)). أولا ، معطف - 1 سال جنب مع ما يقرب من 0.1 100μl ملغ / مل العقيمة الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد (مانهايم بورنغير كوربوريشن ، في انديانابوليس) ، مع الحرص على عدم تسرب السائل أكثر على الجانب بولي HEMA. إجازة لمدة ثلاث ساعات ، ثم إزالته. غسل نفس المنطقة مع حل رينغر العقيمة مرة واحدة أو مرتين ، ثم ضع 100μl سال طاف - 1 ، مع الحرص على عدم تسرب السائل الى الجانب بولي HEMA للطبق. على الضد first يضمن المغلفة سال - 1 عند تركيز معروفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأطباق مع ليلة وضحاها سال - 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل سال - 1 الأضداد وشطف المنطقة مع حل رينغر العقيمة ل. 2 مل أعرض المتوسطة إلى الطبق قبيل الطلاء الخلية. </li></ol> تم العثور على تكوين الحل رينغر البرمائيات ، وخالية من مصل المتوسطة البرمائيات ، والحل رينغر للهضم أنزيم في MacLeish تاونز وأندرسون (1988) وآخرون مانديل. (1993). إعداد الثقافات الخلية وقد استمدت هذه الخلايا المستخدمة في هذا الفيديو من الضوء مكيفة ، والكبار والمائية المرحلة نمر السلمندر (Ambystoma tigrinum) ، وقياس 17-22 سم في الطول (تشارلز سوليفان ، وشركة ناشفيل بولاية تينيسي) ، حافظ على 5 درجات مئوية على ح 12 : 12 ساعة للضوء الظلام دورة. وتمت الموافقة على البروتوكولات التي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي ، وفقا للمبادئ التوجيهية الصارمة من المعاهد الوطنية للصحة. ووصف إجراءات لإعداد الثقافات خلايا شبكية بواسطة نحمان - Clewner تاونز واندرسون (1996) و هي كما يلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس وباب الحيوانات. إزالة العيون وتشريح خارج القرنيات وقزحية العين. ينبغي للفصل شبكية العين قليلا داخل فنجان العين. عن طريق وضع ملقط المنحني تحت شبكية العين ، مغرفة خارج شبكية العين. ليس من المهم إذا تم إرفاق العدسة إلى الشبكية في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم في شبكية العين غراء يو / مل 14 (رثينجتون ، التملك الحر ، ونيو جيرسي) في حل السمندل رينغر لمدة 40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدامها ، ينبغي فقاعات الحل رينغر غراء مع O 95 ٪ 05/02 ٪ أكسيد الكربون غاز 2 لمدة 30 دقائق. ، ثم تعقيمها قبل المرور عبر فلتر ميكرون 0.22 (ميليبور ، Carrigtwohill ، ايرلندا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكية العين بمحلول معقم السمندل رينغر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العدسات من الحل رينغر ، ثم يسحن بلطف الأنسجة الشبكية مع 3 ملم تحمل ماصة لتسفر عن التعليق الخلية. </li></ol> ملاقط ليزر التلاعب من الخلايا العصبية معزولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق الثقافة على المسرح المجهر ، وتوجيه الطبق عن طريق مواءمة علامة على الطبق مع نقطة مرجعية على الساحة. حفظ إحداثيات نقاط إيمانية في الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا على حد سواء سال (1) وبولي HEMA نصفي للطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح هذه الخلايا إلى تسوية لحوالي 20 دقيقة ، وهي مدة كافية لخلايا على الجانب ملتصق من صحن لإرفاق الركيزة الأضداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خلية على الجانب سال - 1 ملتصقة للطبق. علامة x و y المرحلة إحداثيات موقف قريب من الخلية. في حالتنا ، فإن النقطة 10μm تقريبا من التشعبات الأساسي للخلية المحددة. حفظ الإحداثيات في جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا العصبية الثانية ، في حال رئيسنا على مستقبلة للضوء ، وعلى الجانب بولي HEMA من صحن واستخدام أداة الليزر لاعتراض منتاش عليه. لا يمكن أن يتحقق محاصرة أكثر من مجموعة واسعة من مستويات السلطة. ومع ذلك ، وضعنا قوة الليزر على 10 ٪ -20 ٪ ، وهي نسبة منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الحطام محاصرة مع الخلية ، ولكنها كافية لنقل الخلية من خلال وسيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين عقد الخلية في الفخ ، وانخفاض في مرحلة الخلية بحيث أصبح أعلى بكثير من سطح الطبق والثقافة ، وفوق أي الخلايا العصبية المرفقة. التحرك في المرحلة تحت سيطرة الكمبيوتر لجعل الخلية إلى س حفظها سابقا ، وينسق ذ على الجانب - 1 سال. تم تعيين حركة المسرح في ليالي / 8 20μm ، ولكن ينبغي أن تحدد السرعة القصوى تجريبيا. عند وصوله إلى الوجهة نقطة على الجانب سال - 1 ، ورفع هذه المرحلة لتحقيق الخلية المحاصرين على سطح الطبق. ويمكن إجراء التنسيب الخلية مع دقة من بضعة ميكرونات. السماح للخلية التمسك الركيزة - 1 سال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور الرقمية على حد سواء من الخلايا في الزوج قبل وبعد تشكيل الزوج يوفر سجلا مفيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أزواج خلية في حاضنة. لخلايا السمندل ، ضع الأطباق في غرفة ترطيب في 10 درجة مئوية. يمكن رصد الخلايا الفاصل الزمني الفيديو واستخدامها مع أي تقنية بيولوجية الخلية المطلوبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+Single-Beam+Gradient+Force+Optical+Trap+for+Dielectric+Particles.">Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles.</a> Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).</li><li>Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+and+rod+cells+have+different+target+preferences+in+vitro+as+revealed+by+optical+tweezers.">Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers.</a> Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+localized+cell+heating+induced+by+infrared+optical+tweezers.">Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).</li><li>MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro.">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).</li><li>MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+synapse+formation+among+major+classes+of+adult+salamander+retinal+neurons+in+vitro.">Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro.</a> Neuron. 1, 751-760 (1988).</li><li>Mandell, J. W., MacLeish, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Townes-Anderson+E.+Process+outgrowth+and+synaptic+varicosity+formation+by+adult+photoreceptors+in+vitro.">Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro.</a> J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).</li><li>Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-induced+remodelling+and+regeneration+of+the+ribbon+presynaptic+terminal+in+vitro.">Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro.</a> J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).</li><li>Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+retinal+neurons+by+optical+tweezers.">Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers.</a> Mol. Vis.. 4, (1998).</li></ol>

الضوء والزخم ، وعندما شعاع الضوء ينكسر عند مروره من خلال خلية ، لا بد من القوة لتغيير اتجاه الزخم. بسبب قانون الحفاظ على الزخم ، يجب أن يشكل قوة في الاتجاه المعاكس ، في المقابل ، رد فعل مرة أخرى على الخلية. وأظهرت Ashkin (1991) أن القوة التي تم إنشاؤها بواسطة أشعة الليزر التي تركز عدسة ا?...

<table><tbody><tr><td>25mm circle No.1 coverglass</td><td>VWR international</td><td>48380 080</td><td></td></tr><tr><td>poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3932</td><td>Dissolve in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG antibody</td><td>Chemicon International</td><td>AP181</td><td> 1mg in 1ml, dilute 10x for use</td></tr><tr><td>Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody</td><td>generously provided by Dr. Peter MacLeish</td><td></td><td>Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA</td></tr><tr><td>3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets</td><td>Corning</td><td>7078A-5</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes 35mm x 10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical tweezers-microtool or laser tweezers</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 inverted light microscope</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x oil immersion plan neofluor objective lens</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Numerical aperture (N.A. 1.3)</td></tr><tr><td>Black and white CCD camera</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer and joystick with software</td><td>Cell Robotics Inc.</td><td></td><td>for controlling a motorized stage</td></tr></tbody></table>

using laser tweezers for manipulating isolated neurons in vitro

في هذه الورقة ، والفيديو ، ونحن تصف البروتوكولات المستخدمة في المختبر لدينا لدراسة تفضيلات استهداف عمليات تجديد الخلايا من الخلايا العصبية للشبكية الكبار في المختبر. إجراءات لإعداد الثقافات خلايا شبكية تبدأ عملية الهضم ، وتشريح سحن من شبكية العين ، وتنتهي مع طلاء للخلايا الشبكية معزولة على أطباق مصنوعة خصيصا للاستخدام مع ملاقط الليزر. وتنقسم هذه الأطباق في خلية half اللاصقة والمواد الطاردة للنصف الخلية. وهي مغلفة الجانب اللاصق الخلية بطبقة من الأضداد - 1 سال ، والتي توفر الركيزة التي تقوم عليها خلايانا النمو. ويمكن استخدام لاصق ركائز أخرى لأنواع الخلايا الأخرى. وهي مغلفة الجانب طارد الخلية بطبقة رقيقة من البولي HEMA. محاصرون الخلايا مطلي على الجانب بولي HEMA للطبق مع ملاقط الليزر ونقلها ثم وضعت في زنزانة مجاورة على الجانب - 1 سال لخلق الزوج. وينبغي تشكيل مجموعات من أي حجم الخلية يكون ممكنا مع هذه التقنية. &quot;الليزر ملاقط المجهرية التي تسيطر عليها&quot; يعني أن المحقق يمكن اختيار أي خلايا للتحرك ، والمسافة المطلوبة بين الخلايا يمكن أن تكون موحدة. لأن شعاع الليزر يمر عبر سطوح شفافة من صحن والثقافة ، وتتم تحديد الخلية والتنسيب في بيئة مغلقة معقمة. يمكن رصد الخلايا الفيديو مرور الزمن وتستخدم مع أي تقنية بيولوجية الخلية المطلوبة. هذه التقنية قد تساعد التحقيق في خلية خلية التفاعلات.

Watch this Scientific Journal Video about Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro at JoVE.com

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

هذا الفيديو يصف التلاعب في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الليزر ملاقط في المختبر.

باستخدام الملقط ليزر لمعالجة الخلايا العصبية معزولة في المختبر

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

using-laser-tweezers-for-manipulating-isolated-neurons-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Views.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey - UMDNJ. هذا الفيديو يصف التلاعب في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الليزر ملاقط في المختبر.

Video: Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

القبض على الليزر Microdissection ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

قياس الافراج عن التوتر أثناء المستحثة بالليزر اكسون الآفات لتقييم التصاق محور عصبي إلى الركيزة في Piconewton والقرار ملي

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Bioengineering

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...