We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission&#8217;s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the &#8220;Stem Cells Call for Proposals.&#8221; This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by &#8220;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&#8221;.

1. وصفها محور عصبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الألياف التسلق يمكن أن توصف عن طريق حقن الأصباغ العضوية مترافق إما إلى الأعلى dextrans الوزن الجزيئي أو البلازميد / الفيروسات التي تحفز على التعبير عن البروتينات الفلورية 26-29. في هذا البروتوكول، ويتم حقن الصبغة العضوية فلور اليكسا 488 ديكستران في الزيتون أدنى لتسمية الألياف التسلق وتصور لهم في القشرة المخيخ (الشكل 1). وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل وزارة الصحة الإيطالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير أنبوب زجاجي الشعرية عن طريق سحبها على ساحبة micropipette. تقليم غيض من أنبوب زجاجي الشعرية مع مقص حتى قطرها الخارجي حوالي 30 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الشعرية مع 1-2 ميكرولتر من صبغ ديكستران مترافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء، تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف. أثناء الإجراء، والحد من مخاطر التلوث باستخدام معقم الزجاج حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس (9-12أسابيع) عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (9 ملغ / كلغ). ضمان مخدرا الحيوان بشكل كامل باستخدام الذيل و / أو القرصات أخمص قدميه. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الشعر فوق الرقبة إما مع شفرة حلاقة أو كريم إزالة الشعر. المسحة موقع الجراحية مرتين مع بتدين، تناوبت مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على حامل التجسيمي. إبقاء الحارة الحيوانية مع وسادة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع برفق earbars على العظام بجانب الأذنين بحيث يتم عقد رئيس بحزم. تدوير رأس لتشكيل زاوية 140 درجة مع الجسم. ويمكن الحصول على الاتجاه المطلوب عن طريق تغيير بلطف ذروة الأنف حامل قضيب على حامل المجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بعض قطرات من يدوكائين على الجلد بين الأذنين. استخدام ملقط أو شفرة حلاقة لإجراء شق عمودي من حوالي 1 سم على الجلد تحت قفا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بلطف الأنسجة والعضلات تحت الجلد بواسطة الملقط حادةو تحت المجهر تشريح. دفع إلى أسفل حزمة العضلات الأفقية وعقد عدا اثنين العضلات العمودية كراسات من أجل فضح الجافية أكثر من ماغنوم الثقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحذر الشديد، تشريح الجافية مع إبرة حقنة أو ملقط حادة جدا لفضح الدماغ. كمية صغيرة من السائل الدماغي الشوكي قد تمتد إلى عندما تم قطع الجافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على مياداة مجهرية المجسم، وتناوب على حامل الشعرية 45 درجة من رأسي. وضع الشعرية في خط الوسط، في نقطة الوسط بين الحافة الذيلية للقشرة المخيخ وأول فقارة عنق الرحم. إدراج ماصة على عمق 2 ملم من السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليم وحدة تخزين 0.5-1.5 ميكرولتر من صبغة أكثر من 10-15 دقيقة. نظام حقن مكروي الاستغناء يسمح تسليم الضغط رقابة من السائل في الشعرية (ضغط النبض = 20 رطل؛ مدة النبضة = 3-4 ميللي ثانية؛ تيرة نبض التسليم = 12 هرتز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشعرية في المكان لمدة 15 دقيقة، ثم ببذ (في 2-3 دقيقة) إزالته. إعادة محاذاة بدقة-العضلات وخياطة الجلد فوق. إبقاء العضلات رطبة بشكل جيد من خلال تطبيق بعض المالحة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الجفاف، وضخ تحت الجلد 0.5 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم. الحفاظ على الحيوانات في قفص ساخنة حتى الشفاء التام من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الجلد إدارة كاربروفين (5 ملغ / كغ) يوميا لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة. </li></ol> 2. إطار بصري على مخيخي اللحاء ملاحظة: يتم نقل الصبغة في 2 أسابيع من نواة الزيتوني أدنى يصل إلى القشرة المخيخ إلى محطات جنة الأمن الغذائي العالمي (انظر الشكل 1). لجنة الأمن الغذائي المسمى قليلة يمكن تصور تحت النافذة في الجمجمة الدائمة التي يمكن القيام بها على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس كما هو موضح أعلاه. استخدام القرصات اصبع القدم للتحقق من الحيوان مخدرا بشكل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الشعر فوق الرأس، ومسح كورونافي الضربات الشديدة بالتناوب مع 70٪ من الكحول وبتدين وتطبيق مرهم العين. ضع الماوس في إطار التجسيمي ووضع قضبان الأذن من أجل الاستمرار بقوة في الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الجلد إدارة ديكساميثازون (0.2 ملغ / كلغ) وكاربروفين (5 ملغ / كلغ) لمنع تورم في الدماغ والتهابات ممكن في موقع نافذة الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة من يدوكائين على الجلد فوق الجمجمة وقطع رفرف، من بين الأذنين إلى فوق العينين. تطبيق حل يدوكائين مرة أخرى على السمحاق قبل تجريف مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حفر الأسنان إلى رقيقة منطقة الهلالية من الجمجمة فوق المخيخ. وعادة ما يتم وضع إطار المركزية ونحو خياطة الظهر، بحيث عمق الجمجمة هو ثابت تقريبا في جميع أنحاء محيط نصف دائرة. تحديد المواقع نافذة قريبة جدا من خياطة لامدا والحفر المتكرر على هذه المنطقة سميكة جدا قد يؤدي إلى ارتفاع درجة حرارة الدماغ وتشكيل الكثير من تورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرقئالاسفنج على الجمجمة في حالة النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ساترة إلى نصفين بمساعدة شفرة حلاقة وملاقط. تأكد من أن ساترة هو أكبر قليلا من جزيرة العظام، ولها شكل مشابه قبل إزالة رفرف العظام مع ملاقط؛ إذا لم يكن كذلك، إعادة تشكيل ساترة أو اختيار واحد آخر. لا تلمس الأم الجافية مع ملاقط أثناء الرسم قبالة العظام. وضع بعناية أسفل ساترة على الجافية. ملاحظة: التزام السطح كله من الزجاج على الجافية والتنبأ من النوافذ الجمجمة طويلة الأمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فقاعات الهواء تحت الزجاج من قبل الشطف مرارا وتكرارا مع محلول ملحي وتجفيف بالعصي القطن. وهذا سوف يساعد أيضا إزالة بعض الدم المتبقية التي قد امتد الخروج من الشعيرات الدموية الصغيرة بعد تحديد المواقع الزجاج. ختم النافذة مع خليط من الغراء الاكريليك والاسمنت الأسنان 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة في غرفة الإنعاش حتى تعافى تماما من التخدير. لا إعادةبدوره الفئران في قفص المنزل حتى تعافى تماما؛ لا تترك لهم غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الجلد إدارة كاربروفين (5 ملغ / كغ) يوميا لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة. </li></ol> 3. في فيفو متعدد الفوتون الليزر Axotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار 2-7 أيام من الجراحة قبل إجراء الدورة الأولى التصوير. يتم توفير مخصص بنيت المجهر ثنائي الفوتون تستخدم هنا مع تي: مصدر ليزر الياقوت (120 خ البقول العرض، معدل الرسوب 90 ميغاهيرتز) والتي يتم تفحص أول مرة من قبل زوج من المرايا galvanometric ثم ركزت على عينة من قبل الغمر بالماء 20X الهدف (NA 0.95، WD 2 ملم). مرحلة كهرضغطية حلقة مغلقة يؤدي التشريد المحوري تصل إلى 400 ميكرون الهدف. أنابيب مضخم جمع إشارة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان، ثم وضع الرأس في حامل المجسم بحيث يضع النافذة في الجمجمة موازية لobjectiلقد البؤري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكشاف مع TPF التصوير القشرة تحت النافذة في الجمجمة. اختيار محوار للتلف من بين ألمع منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على Z-كومة (عادة ما يكون مجال الرؤية هو 100 × 100 ميكرون 2، 512 X 512 في بكسل، 2 ميكرومتر خطوة ض محور) للحصول على 3D اعادة البناء للمحوار المستهدفة. ضمن حجم تصويرها، واختيار موقع الآفة على غصن محور عصبي التي تقع موازية في معظمها إلى المستوى البؤري. هذا التوجه يسمح ليسجل بسرعة التغيرات المورفولوجية، والتي هي التنبؤية لتشريح ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق مع الطاقة العالية الجرعة النقطة المحددة على الجزء الأعلى من CF. يتم ذلك من خلال برنامج ابفيف: زيادة قوة الليزر 5-10X أكثر من الطاقة المستخدمة للتصوير (≈ 300 ميغاواط، وتقاس بعد عدسة الهدف)، تعيين موضع المرايا galvanometric للقيام المسح الضوئي خط (~ 4 - 10 ميكرون) في موقع الآفة وفتح مصراع الليزر ل400-600 ميللي ثانية. توجيه الفحص خطعمودي على الطائرة CF إلى القطع تماما محور عصبي. تشعيع البقع أكثر إشراقا (على سبيل المثال، دوالي) عادة ما يساعد تشريح محور عصبي. الطول الموجي لليزر axotomy هي نفسها المستخدمة للتصوير (920 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة مضان من محور عصبي في المنطقة المعرضة للإشعاع يقلل بسبب photobleaching من عابر. الحصول على كومة من نفس المنطقة بعد دقائق قليلة من التشعيع لضمان الاجتثاث تم أداؤها جيدا. إذا بدأت المنطقة تورم وشكلت محور عصبي هياكل تشبه حبة، تم تشريح الخلايا العصبية بنجاح. في هذه الحالة، في غضون ساعات قليلة (من بضع عشرات من دقيقة إلى 24 ساعة) في الجزء الأعلى من محور عصبي سوف تتحول وتختفي تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للأسف جرعة الطاقة اللازمة لإنتاج axotomy كاملة لا يمكن التنبؤ بها دائما. إذا كانت النتيجة الوحيدة للتشعيع وphotobleaching من ومضان ينبغي استردادها بسرعة بسبب صبغ نشرها، وينبغي تكرار مرة أخرى لتشعيع فعالةلاي تشريح محور عصبي. أيضا، في حالة علامات تورم لا تظهر ضمن 5-20 دقيقة، أو يتبع تورم عن طريق الانتعاش (. بالقياس إلى ما تم وصفها لdendrotomy الليزر، انظر أليجرا MASCARÓ وآخرون 23)، حاول مرة أخرى مع زيادة بالاشعة جديدة يسكن الوقت و / أو قوة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة إعادة عرض في نهاية المطاف محور عصبي في الأيام التي تتبع يزر axotomy مع اثنين من الفوتون في الجسم الحي التصوير (الشكلين 2 و 3). يتم استخدام نمط الأوعية الدموية كما نمط إشارة إلى استرداد محوار تشريح في الأيام التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت الجلد إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) كل دورة التصوير طوال مدة التجربة. </li></ol>

<ol>
	<li>Strata, P., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+olivocerebellar+pathway.">Plasticity of the olivocerebellar pathway.</a> Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).</li><li>Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Sacconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Allegra Mascaro, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single+branch+axotomy+induces+GAP-43-dependent+sprouting+and+synaptic+remodeling+in+cerebellar+cortex.">In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).</li><li>Ylera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-injured+adult+sensory+neurons+gain+regenerative+competence+upon+a+lesion+of+their+peripheral+axon.">Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon.</a> Curr Biol. 19, 930-936 (2009).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+elimination+and+protection+after+minimal+injury+depend+on+cell+type+and+their+prelesion+structural+dynamics+in+the+adult+cerebral+cortex.">Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex.</a> J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+and+regeneration+a+mechanistic+tug+of+war.">Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war.</a> J Neurochem. 108, 23-32 (2009).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Luo, L., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+retraction+and+degeneration+in+development+and+disease.">Axon retraction and degeneration in development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).</li><li>Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanycytes+present+in+the+adult+rat+mediobasal+hypothalamus+support+the+regeneration+of+monoaminergic+axons.">Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons.</a> Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).</li><li>Morrison, E. E., Costanzo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+olfactory+sensory+neurons+and+reconnection+in+the+aging+hamster+central+nervous+system.">Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system.</a> Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).</li><li>Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+therapeutics+regeneration+or+sprouting+or+plasticity.">Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity.</a> Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Two-Photon+Excitation+Microscopy+and+Its+Applications+to+Neuroscience.">Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+regulate+dynamic+equilibrium+of+presynaptic+terminals+in+mature+hippocampal+networks.">AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks.</a> Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).</li><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain.">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li><li>De Paola, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+structural+plasticity+of+axonal+branches+and+boutons+in+the+adult+neocortex.">Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex.</a> Neuron. 49, 861-875 (2006).</li><li>Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+nanosurgery+in+live+brain.">Multi-photon nanosurgery in live brain.</a> Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).</li><li>Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+climbing+fibres+surviving+a+subtotal+lesion+of+the+inferior+olive+in+the+adult+rat.+II.+Synaptic+organization+on+reinnervated+Purkinje+cells.">Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells.</a> The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).</li><li>Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reparative+mechanisms+in+the+cerebellar+cortex.">Reparative mechanisms in the cerebellar cortex.</a> Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).</li><li>Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sprouting+and+axonal+atrophy+in+cerebellar+climbing+fibres+following+in+vivo+silencing+of+the+growth-associated+protein+GAP-43.">Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43.</a> PLoS One. 6, e20791 (2011).</li><li>Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+motility+and+its+modulation+by+activity+are+branch-type+specific+in+the+intact+adult+cerebellum.">Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum.</a> Neuron. 56, 472-487 (2007).</li><li>Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entire+trajectory+of+single+climbing+and+mossy+fibers+in+the+cerebellar+nuclei+and+cortex.">The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex.</a> Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).</li><li>Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+trophic+interactions+between+climbing+fibres+and+Purkinje+cells+in+the+rat+cerebellum.">Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum.</a> Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. (12), (2008).</li></ol>

We have nothing to disclose.

يظهر هذا البروتوكول كيفية تسمية الخلايا العصبية من الزيتون أدنى مع صبغة الفلورسنت. في وقت لاحق، وصفت طريقة لأداء نافذة الجمجمة على القشرة المخيخ. توفر هذه التقنية إمكانية الوصول إلى جزء البصرية الطرفية من الخلايا العصبية الزيتوني المخيخي، والألياف التسلق. للأسف، ونتائج كل من وضع العلامات وجراحة حج القحف منخفضة جدا حتى في يد المشغلين المهرة (عادة 1 من 3 الفئران هو المسمى، و1 من 3 نوافذ الجمجمة لا يزال واضحا بعد 1-2 أسابيع). ثم يتم عرض هذا الإجراء لأداء يزر axotomy في الفئران الحية. يسمح هذا الأسلوب تشريح الخلايا العصبية فلوري في المواقع المستهدفة. بينما النماذج إصابة شائعة الاستخدام، إما عن طريق فك الميكانيكية أو استخدام المواد الكيميائية، وتسبب اضطراب هائل من أنسجة المخ، وقوة رئيسية من هذا النموذج هو الحبس مكانية عالية وخصوصية. في الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن العمود الفقري واحدة يمكن أن يكون ذاب في حين أن يجنب رانه السلامة الهيكلية للالتغصنات الأم 5؛ وعلاوة على ذلك، والفروع محور عصبي واحد يمكن أن تتعطل تجنب تشكيل ندبة الدبقية المستمرة 6. يمكن ثم تليها عملية انحطاط في الوقت الحقيقي، وكذلك إعادة عرض في نهاية المطاف من الخلايا العصبية بجروح. بالتالي فإن هذا الأسلوب هو أداة قوية لدراسة آلية أساسية من اللدونة الهيكلية محور عصبي في الجسم الحي. إمكانية تشريح الهياكل اختيارها يعتمد إلى تقريب الأولى على عمق الهيكل وعلى كثافة الانبعاثات مضان لها. على الرغم من أن اثنين من الفوتون المجهري يسمح الخلايا العصبية التصوير تصل إلى 600-800 ميكرون عميقة، وجدنا أن nanosurgery يقتصر على الطبقات الأولى من القشرة (تصل إلى 300 مم). في هذا البروتوكول يزر axotomy كان مستهدفا لألياف تسلق المخيخ، ولكن يمكن استخدامه لتشريح أي هيكل الفلورسنت في الدماغ مباشرة. وقد استخدمت أشعة الليزر لتشريح العصبية واحد مليرة لبنانية الهيئات والفروع الشجيرية، محاور عصبية أو العمود الفقري واحدة من الخلايا العصبية الهرمية GFP المسمى في القشرة من الفئران المعدلة وراثيا 5،8،9،23.

وعادة ما يعقب transection محور عصبي الناتجة عن الإصابة الميكانيكية، وإهانة سامة أو أمراض الاعصاب بواسطة انحطاط الجزء القاصي من محوار أن يتم فصل من خلايا الجسم 10-13. مع وجود استثناءات قليلة 2،7،14،15، محاور قطعت في الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الكبار غير قادرين على تفعيل برنامج إعادة نمو 16 عادة. لا يعرف الكثير عن ديناميات الوقت الحقيقي من الأحداث التنكسية على المستوى الخلوي والتحت خلوية. تطوير استراتيجيات جديدة للحد من الأضرار العصبية وتعزيز إعادة نمو الخلايا العصبية يتطلب، كخطوة أولى، وتوضيح الآلية التي الخلايا العصبية المصابة متفرد تتدهور والتجدد. وتعالج هذه الدراسة بشكل مباشر عن طريق رصد ديناميات الخلايا العصبية واحدة في الجسم الحي. في حين أن تقنيات فوتون واحد التصوير مضان محدودة بسبب تشتت مكثفة من الضوء المرئي، واثنين من الفوتون الإثارة تصل إلى الطبقات القشرية في عمق لىلقد الفئران مع التحت خلوية القرار 3،4،17. الاستفادة من الفئران المعدلة وراثيا والتي يتم التعبير عن البروتينات الفلورية انتقائي في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية 18-20، وقد تم تطبيق TPF المجهر لاستكشاف اللدونة متشابك واستطالة محور عصبي أثناء التطور في الجسم الحي 21،22. تي انه قدرة الخلايا العصبية التالفة متفرد ل تنمو بعد الاصابة يمكن التحقيق من قبل اقتران في رصد المجراة من قبل اثنين من الفوتون التصوير مع نموذج للإصابة تستهدف على وجه التحديد إلى محوار من الفائدة. وقد استخدم امتصاص الفوتون متعددة من البقول الفيمتو ثانية لتعطيل التشعبات واحد أو حتى العمود الفقري واحدة 5،23. علاوة على ذلك، يسمح هذا النموذج إصابة قطع فروع محور عصبي واحد دون تعطيل التغصنات الاتصال 6. في سياق تشريح الميزات التي تسمح السكان العصبية محددة لتجديد محاور عصبية مرة واحدة التالفة والألياف تسلق المخيخ (CFS) هي نموذج الاشتراكية مفيدةالامتحانات التنافسية الوطنية أنها تحتفظ خصائص البلاستيك ملحوظا بعد الاصابة حتى في الحيوانات البالغة 24،25. مؤخرا، أظهرت التصوير طويلة الأجل لجنة الأمن الغذائي أن هذه المحاور هي قادرة على إعادة نمو في الأيام التي تتبع ليزر axotomy 6. يصف هذا البروتوكول كيفية تسمية الخلايا العصبية زيتوني مخيخي واستطالة لها محور عصبي من خلال تتبع تقدمي. مرة واحدة وصفت الخلايا العصبية من الفائدة fluorescently، فإنها يمكن رصدها بشكل متكرر في نقاط زمنية تعسفية لمدة أسابيع أو شهور تحت نافذة الجمجمة. سيتم بعد ذلك يوضح الإجراء لتشريح الفروع محور عصبي واحد عن طريق يزر axotomy في الجسم الحي. التقنيات المقدمة هنا تقديم رؤى جديدة في آلية إعادة عرض محور عصبي في الجسم الحي، وربما يساعد في وضع استراتيجيات علاجية للحد من تنكس الخلايا العصبية، وتعزيز إعادة نمو محور عصبي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting&#160;</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument Inc</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 (Glass bead sterilizer)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection dispense system</td>
			<td>Picospritzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R)</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>64-0720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses,&#160; 90 MHz repetition rate</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spongostan, haemostatic sponge&#160;</td>
			<td>Ferrosan</td>
			<td>MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvanometric mirrors&#160;</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective&#160;</td>
			<td>&#160;Olympus</td>
			<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier modules&#160;</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>H7710-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW System Design Software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate)</td>
			<td>Boheringer Ingelheim</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rymadil (carprofen)&#160;</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine clorohydrate 2%</td>
			<td>ATI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 dextran</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D22910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser nanosurgery of cerebellar axons in vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

ووصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ وضع العلامات محور عصبي، في الجسم الحي التصوير ويزر axotomy على الخلايا العصبية واحدة. يظهر الجدول الزمني للتجربة في الشكل 1. وذكر مثالا لجنة الأمن الغذائي المسمى مع فلور اليكسا 488 ديكستران وتصور تحت النافذة في الجمجمة في الجسم الحي من قبل اثنين من الفوتون المجهري في الشكل 2. كما ذكرت سابقا 6،27، عرض الفروع تصاعدي الاستقرار عالية طوال فترة المراقبة لعدة أيام . ويبين الشكل 3 مثالا للقطيعة محور عصبي من قبل يزر axotomy من فرع واحد من قوات التحالف. كما هو موضح سابقا، تم إجراء الضرر الناجم عن تشعيع فرع البعيدة (~ 30 ميكرون تحت الحنون) من CF بجرعة عالية الطاقة من الأشعة تحت الحمراء. كما هو مبين في لوحة الثاني من الشكل 3، 15 دقيقة بعد أشعة الليزر على الجزء الأعلى من محور عصبي التي تورم وdegeneتصنيف. بعد اليوم، وجزء من القاصي محوار إلى موقع الآفة اختفت تماما (الشكل 3، D17). وسلط الضوء على جزء تدهورت من السهام الحمراء في مجرى الزمن. تظهر لوحات الماضيين أيضا تشكيل التدريجي للفرع عرضية جديدة (رأس السهم الأخضر) من محور عصبي أصيب (مزيد من التفاصيل حول تنتشر فروع جديدة بعد يزر axotomy في الجسم الحي يمكن العثور عليها في 6). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51371/51371fig1highres.jpg" /> الشكل 1. الجدول الزمني للتجربة nanosurgery الليزر. بعد الحقن في النواة الزيتونية السفلية، وسوف أسبوعين من الانتعاش تسمح تقدمي-ديكستران مترافق صبغ لتسمية الألياف التسلق. ثم يتعرض قشرة المخيخ عن طريق أداء نافذة الجمجمة دائمة. من 2-7 في وقت لاحق، لجنة الأمن الغذائي المسمى ولا يمكن تصوير تحت ميكر ثنائي الفوتونoscope في الجسم الحي في فترات زمنية تعسفية. لا يمكن أن يؤديها في nanosurgery الليزر على محاور عصبية وصفت في أي وقت بعد النافذة في الجمجمة تم زرعها. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51371/51371fig2highres.jpg" /> الشكل 2. الألياف تسلق وضع العلامات. يوضح اللوحة اليسرى مثال على CF المسمى مع فلور اليكسا 488 ديكستران وتصور في الجسم الحي بواسطة TPF المجهري. عرض لوحات اليمين الوقت الفاصل بين الصور من نفس CF من يوم 16 (D16) D18 ل. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51371/51371fig3highres.jpg" /> الرقم 3. يزر axotomy على فرع واحد من الألياف التسلق. تم المشع والخلايا العصبية حيث يشير السهم الأحمر على D16. السهام الحمراء highligHT اختفاء الجزء الأعلى من محور عصبي بعد الليزر axotomy (D18). وأشار فرع عرضية شكلت حديثا من قبل رأس السهم الأخضر. شريط النطاق، 10 ميكرومتر.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo at JoVE.com

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

التصوير ثنائي الفوتون، بالإضافة إلى nanodissection الليزر، هي أدوات مفيدة لدراسة العمليات التنكسية والتجدد في الجهاز العصبي المركزي لقرار التحت خلوية. يظهر هذا البروتوكول كيفية تسمية والصورة وتشريح ألياف تسلق واحد في القشرة المخيخ في الجسم الحي.

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

laser-nanosurgery-of-cerebellar-axons-in-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

8.1K Views.  University of Florence.  التصوير ثنائي الفوتون، بالإضافة إلى nanodissection الليزر، هي أدوات مفيدة لدراسة العمليات التنكسية والتجدد في الجهاز العصبي المركزي لقرار التحت خلوية. يظهر هذا البروتوكول كيفية تسمية والصورة وتشريح ألياف تسلق واحد في القشرة المخيخ في الجسم ا...

Video: Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

في فيفو التصوير المتعدد الوسائط، وتحليل للماوس المستحثة بالليزر طراز نيوفاسكولاريزيشن تشورويدال

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

تقييم الحث علي الاكتئاب علي المدى الطويل في شرائح البالغين المخيخار

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...