وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة EY0081 المنح و5T32UY07145 وعين فرسان مؤسسة فرسان. جايسون Rihel زميل بريستول سكويب لمؤسسة أبحاث علوم الحياة.

هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لتنفيذ الاستجابة الحسية الحركية من اليرقات الزرد إلى الزيادات الخفيفة والتناقصات في المختبر الخاص بك. الزرد هي نموذج كبير لنظام الدراسات السلوكية. فهي سهلة للحفاظ على ، لديهم أحجام مخلب كبير ، وأنها تتطور بسرعة. على سبيل المثال ، عيون اليرقات الزرد تستجيب لضوء النهار 3 من التنمية ، وأنها في الوقت الذي يبدي استجابة جفل. الجزء 1 : التصفيحات الأسماك الفردية في 96 لوحة جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو اليرقات وزن تحت دائرة الظلام / الضوء عند 28 درجة مئوية على الأقل حتى آخر أيام 4 الإخصاب (DPF). لدينا نموذجية ضوء : دورة الظلام هو 14 ساعة من الأضواء بدءا من الساعة 9:00 صباحا ، و 10 ساعة من خارج الاضواء ، ابتداء من الساعة 11:00. لتحقيق نتائج أفضل والسلوكية ، وتجنب الازدحام ، ونحن عادة لا تبقي أكثر من 50 اليرقات في طبق بتري واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 DPF ، والزرد على استعداد لنقلهم الى لوحة 96 - جيدا. لإعطاء مزيد من غرفة اليرقات السباحة ، ونحن عادة استخدام لوحة 96 - جيدا مع الحجم الكبير جيدا من 650 ميكرولتر ، ومع ذلك ، ومعيار جيد لوحات 96 - تعمل على ما يرام. باستخدام الماصة نقل من البلاستيك ، ونقل بلطف one يرقة لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل الأسماك في الآبار ، وملء كل جيدا مع أسماك المياه ما يكفي من هذا القبيل أن تدفق المياه السطحية تقريبا إلى الجزء العلوي من الآبار. يمكن الملئ أو رتبة أدنى البئر قد يسبب مشاكل بصرية للكاميرا التسجيل. أيضا ، والحرص على عدم إدخال فقاعات في الآبار. </li></ol> الجزء 2 : مسح للجهاز تسجيل لهذا الجزء من البروتوكول ، يرجى الرجوع إلى الفيلم لتحديد مكوناتها وللتآلف مع مجموعة لدينا ما يصل من جهاز تسجيل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل غرفة تسجيل مكانا جيدا لوضع تعريف لوحة 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع الكاميرا في الظهر ، وركز على اللوحة باستخدام المرايا خارج منطقة الجزاء. ويمكن تعديل زاوية من هذه المرايا التي تحول البراغي التي تمسك المرايا في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير مضاءة في غرفة التسجيل من أسفل عن طريق المصابيح الحمراء. هذا يسمح للكاميرا لرؤية الأسماك حتى في الظلام. اليرقات لا يمكن الكشف عن ضوء الأشعة تحت الحمراء ، وحتى هذه الإضاءة الحمراء ثابت لا تؤثر على التجربة. تضيء المصابيح البيضاء أيضا من غرفة تسجيل أدناه. يتم التحكم فيها بشكل منفصل عن الاضواء الحمراء. تنير الغرفة مع الضوء الأبيض من فوق أو من الجانبين هو ممكن بالتأكيد ، ولكن في هذه الحالات ، يجب توخي الحذر لتجنب قوي يبرز على نحو فاضح قبالة المياه السطحية التي قد تتداخل مع الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التجارب التي تستمر لفترة أطول من بضع ساعات ، وملء الغرفة مع ادارة المياه برفق للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة ثابتة لفترة تجريبية. طريقة واحدة لتحقيق تدفق مستمر من المياه على ضخ المياه من الخزان بواسطة مضخة ماء صغير يتم تسخينها إلى 28 درجة مع سخان ماء تحت الماء نموذجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقليل الاهتزاز طائشة من الغرفة ، وينبغي أن وحدة تسجيل كامل الجلوس على قمة جدول التوازن الثقيلة. </li></ol> الجزء 3 : محاذاة لوحة 96 - جيدا مع شبكة الكمبيوتر لتعقب الفيديو البرمجيات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة 96 - جيدا تحتوي على الأسماك في غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام حمام الماء ، ومكان لوحة ببطء في الماء ، مما يعطي مستوى المياه فرصة للتكيف من دون إراقة على طبق. بدلا من ذلك ، بإغلاق تدفق المياه ، وإضافة لوحة ، ومن ثم استئناف التدفق. أيضا ، تأكد من استخدام الربيع أو الشريط المطاطي لعقد لوحة 96 - جيدا في مكانها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وجهة النظر Videotrack البرمجيات ، والتحقق من أن جميع اليرقات من تجربتك مرئية على شاشة الكمبيوتر. باستخدام عناصر التحكم في البرمجيات ، ومحاذاة الشبكة من برامج فيديو لتتبع مع آبار صحنك ان كل هذه الاسماك هو داخل مربع من الشبكة. وسوف يكون جهاز الكمبيوتر تتبع حركة حساب منفصل لكل من هذه المربعات ، حتى إذا كنت ترفض تعديل شبكة الكمبيوتر قد تفقد بعض الحركات الأسماك. أو حتى أسوأ من ذلك : وسمكتين المتاخمة احتلال المنطقة نفسها ، وتحسب واحدة الأسماك. هذه الخطوة مهمة جدا لجميع التسجيلات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المحاذاة ، برنامج توقيت عندما الاضواء يجب ان تذهب وخارجها. نسمح عادة 3 ساعات من الضوء أو الظلام التكيف في المربع سواء للحصول على مستوى النشاط الأساسي ، ولكن أيضا لإعطاء فرصة ليرقات تهدأ بعد pipetting والتعامل معها. بعد الأساس ، ونحن مع بديل ثم 30 دقيقة من الأضواء على تليها 30 دقيقة من خارج الأضواء ، وكرر عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وأغلق باب غرفة تسجيل وبدء التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الممارسة العملية ، نسجل نشاط كل الأسماك في الثانية الواحدة ، ولكن برنامج وجهة نظر في واقع الأمر الإطار سجلات ببيانات الإطار (إشارة إلى فيلممظاهرة لجمع البيانات). وتحديد قيمة العتبة الدنيا للتغيير بكسل لكل إطار تعتمد إلى حد ما على الكاميرا الخاصة والإعداد الخفيفة. الإعداد لدينا ، ونحن عادة استخدام عتبة 4 بكسل ، وهذا هو ، إذا كان أقل من 4 بكسل آخذة في التغير ، فهو يعتبر الخلفية. إذا كان أكثر من 4 بكسل تتحرك ، فهذا دليل على السمك يتحرك. ونحن مصممون ان يكون تجريبيا بالكشف عن قطع ما يقرب من جميع تسبح اليرقات والحركات بدورها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الرغم من أن صناديق تسجيل عزل اليرقات جيدا ، إيقاف الضوء في الغرفة ، والحرص على تقليل الانقطاعات مع الضوضاء الميكانيكية مثل إغلاق وفتح الأبواب في الغرفة ، وجود طرف والرقص ، أو القيام بممارسة إجراءات الخاص بك. </li></ol> الجزء 4 : تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال التجربة ، ونقل البيانات التي يتم جمعها في ورقة Excel أو في الجناح الخاص بك تحليل المفضلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الورقة المرفقة التفوق هو مثال لما قد تبدو البيانات مثل : أنه يحتوي على الوقت في ثوان من بداية التجربة والنشاط في كل يرقة ثانية للأسماك جميع أنحاء التجربة كلها (انظر على سبيل المثال ملف البيانات التكميلية في ملفات المقطع من هذه الصفحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويظهر الشكل 1 مثالا للنشاط من يرقة واحدة. الرقم 2 هو تتبع ممثل من متوسط ​​40 يرقات الزرد WT. متوسط ​​ON OFF والاستجابات بارزة ومتسقة. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="الشكل 1" width="569" height="398" /> الشكل 1 : نشاط سمكة واحدة ونشاط من السمك في وزن واحد في 5 DPF ردا على فترات متناوبة من 30 دقيقة من الضوء على والخروج. وأشارت الردود عليها السهام السوداء والاستجابات OFF مع السهام الحمراء. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="الشكل 2" width="577" height="387" /> الشكل 2 : نشاط متوسط ​​من 40 سمكة نشاط متوسط ​​وزن الأسماك 40 في 5 DPF ردا على فترات متناوبة من 30 دقيقة من الضوء على والخروج. متوسط ​​ON (الأسهم السوداء) وOFF (السهام الحمراء) ردود بارزة ومتسقة. </li></ol> 5. ممثل النتائج الرقم 3 هو مخطط التخطيطي للمخطط التجريبية المستخدمة في كل من تجاربنا. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="الشكل 3" width="530" height="479" /> الشكل 3. يتم وضع التصميم التجريبي لاختبار المحركات البصرية (VMR) الاستجابة. سمكة) الفردية في لوحة 96 - جيدا في غرفة تسجيل. ويتم قياس نشاط كل الأسماك في الثانية الواحدة. ب) وتعطى الأسماك فترة التكيف مع الظلام أو الضوء لتسوية بينها والحصول على مستوى النشاط الأساسي. فترات من 30 دقيقة على أضواء والأضواء OFF يتم تقديمها على التوالي ليصبح المجموع 3 ساعات. وقد تم تكييف هذا المخطط من بروبير وآخرون ، 2006. ماذا الرسوم البيانية للاستجابة البصرية والسيارات تبدو؟ قمنا بقياس ردود الفعل داخل وخارج الأسماك WT إلى الزيادات الخفيفة والتناقصات. لتأكيد أن هذه الردود كانت تعتمد على وظيفة العين ، وقمنا بقياس نشاط المسوخ CHK ، والتي لا تضع أي العينين. الشكل 4 يبين نشاط متوسط ​​المتحصل عليها من الحيوانات WT فضلا عن المسوخ CHK. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="الشكل 4" width="489" height="212" /> الشكل 4 : WT الأسماك واضحة وإيقاف الاستجابات التي يتم بوساطة العيون الجانبية يتم تسجيل السلوك الحركي لليرقات الزرد في 5 DPF استجابة لمدة 30 دقيقة على ضوء و 30 دقيقة من خارج الضوء في الثانية الواحدة. تتبع كل يمثل متوسطا قدره 480 من 120 WT الردود الفردية (الأزرق التتبع) أو متحولة CHK اليرقات (برتقالي التتبع) التي سجلت ما يزيد على 3 تجارب. والمسوخ CHK لا زيادة كبيرة في نشاطها إما بزيادة أو ضوء التناقصات وتتمتع بمستوى منخفض من النشاط الأساسي. وقد تم تكييف هذا الرقم من عمران وآخرون ، 2007. والبصرية للسيارات ردود من الأسماك NRC متحولة. كان يعتقد أن متحولة NRC أن تكون عمياء تماما استنادا إلى اختبار OKR. في متحولة NRC ، المحطات مبصرة لا شكل صحيح وخطر شديد على مسار والمرئية 1. وكشفت تسجيلات خلية الشبكية العقدة من هذه الأسماك الطافرة التي يعرضون في الغالب خارج الخلية من نوع الاستجابات العقدة ، وبعض الشاذ ON - OFF ، ولكن ليس من النوع النقي في الردود 2. باستخدام اختبار VMR أظهرنا أن متحولة NRC لديه طبيعية خارج الاستجابة وتأخر وبطء الاستجابة ON (SEه الشكل 5). وهكذا ، متحولة NRC ليس أعمى تماما كما كان يعتقد سابقا 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="الشكل 5" width="591" height="244" /> الشكل 5 : mutats NRC زيادة نشاطهم في استجابة للتغيرات في شدة ضوء الاستجابات السلوكية للضوء وإيقاف من وزن اليرقات والمصالحة الوطنية في 5 DPF متحولة. تتبع كل يمثل متوسطا قدره 480 ردود من 120 فرد من الأسماك في كل الوراثي. هو انخفاض طفيف في السلوك الحركي متوسط ​​المسوخ NRC (آثار الوردي) بالمقارنة مع وزن الأسماك (آثار الزرقاء) ولكن لا تزال قوية في أعقاب ضوء OFF التحفيز. لاحظ الوقت ارتفاع بطيء في الاستجابة لمتحولة NRC الضوء على مقارنة الضوء على الاستجابة للأسماك WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

الإجراءات التجريبية نظهر في الفيلم كلها ممثل الأسماك WT. ومع ذلك ، يمكن القيام بالقياس هذه التجارب على الأسماك متحولة كذلك (انظر القسم ممثل النتيجة). نقترح على الأسماك والأسماك WT وحة متحولة على اللوحة نفسها في مخطط متن المدقق لأغراض التحكم الأمثل. عند اس...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

ردة الفعل optokinetic (OKR) هو منعكس البصرية الأساسية التي أظهرتها معظم الفقاريات ، ويلعب دورا هاما في تحقيق الاستقرار في العين بالنسبة للمشهد المرئي. ومع ذلك ، يتطلب أن OKR حيوان الكشف عن خطوط نقل وأنه من الممكن أن الأسماك التي تفشل أن تظهر OKR قد لا يكون أعمى تماما. واحد الزرد متحولة ، وليس استجابة optokinetic ج (NRC) لا يوجد لديه OKR تحت أي ظروف الإضاءة اختبارها وأفيد أن تكون عمياء تماما. سابقا ، لقد أظهرنا أنه يمكن تسجيل OFF - العقدة نشاط الخلايا في هذه المسوخ. لتحديد ما إذا كان السمك متحولة مع عدم وجود مثل OKR متحولة NRC يمكن الكشف عن زيادات بسيطة وخفيفة التناقصات التي قمنا بتطويرها لفحص المحركات البصرية السلوكية (VMR). في هذا الاختبار ، يتم وضع واحد في كل اليرقات الزرد جيدا لوحة 96 - جيدا مما يسمح للرصد في وقت واحد من اليرقات باستخدام الفيديو الآلي لتتبع النظام. وسجلت ردود الحركي كل يرقة الى 30 دقيقة الضوء على و 30 دقيقة خارج الضوء وكميا. وزن الأسماك لديها ارتفاع وجيزة من النشاط الحركي عند أضواء ، والمعروفة باسم الاستجابة الانزعاجية ، تليها العودة إلى أدنى من النشاط الأساسي ، ودعا الى تجميد. WT الأسماك أيضا ارتفاعا حادا نشاطهم الحركي التالية مباشرة خارج الاضواء تدريجيا وفقط (أكثر من عدة دقائق) العودة الى النشاط الحركي الأساس. والمسوخ NRC الاستجابة للضوء وبالمثل كما OFF WT الأسماك ، ولكن يحمل انخفاض طفيف في متوسط ​​نشاطهم مقارنة WT الأسماك. النشاط الحركي تأخر في الرد على الضوء على المسوخ في المصالحة الوطنية وبطيئا. هناك وقت الارتفاع البطيء للاستجابة لمتحولة NRC الضوء على ضوء مقارنة WT على الاستجابة. وتشير النتائج إلى أن المصالحة الوطنية ليست سمكة عمياء تماما. لأن teleosts يمكن الكشف عن الضوء في شبكية العين عن طريق المنظمات غير الأنسجة ، وأكدنا أن الاستجابة الفورية السلوكية للضوء التغييرات تتطلب كثافة عيون سليمة باستخدام (CHK) المسوخ شوخ ، التي تفتقر تماما العينين من المراحل الأولى للتنمية. في مقايسة VMR لدينا ، والمسوخ CHK يحمل أي رد على أي جفل الضوء أو إيقاف تشغيله ، يظهر أن العيون الجانبية التوسط هذا السلوك. وصف مقايسة VMR يكمل هنا مقايسة OKR الراسخة ، والتي لا اختبار قدرة اليرقات الزرد على الاستجابة للتغيرات في شدة الضوء. بالإضافة إلى ذلك ، التشغيل الآلي للمقايسة VMR يفسح المجال لسرعة عالية الكشف عن عيوب في شدة الضوء استجابات مدفوعة البصرية.

Watch this Scientific Journal Video about A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities at JoVE.com

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

طورنا الاستجابة الحسية الحركية لquantitate إخراج السيارات من الزرد اليرقات ردا على الزيادات الخفيفة والتناقصات. فحصنا أيضا المسوخ رؤية الزرد ، بما في ذلك أي optokinetic المسوخ (NRC) ردا على ذلك ، الذي كان يعتقد أن يكون أعمى تماما عند اختباره آخر مقايسة الرؤية ، والمنعكس optokinetic.

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K Views.  Harvard. طورنا الاستجابة الحسية الحركية لquantitate إخراج السيارات من الزرد اليرقات ردا على الزيادات الخفيفة والتناقصات. فحصنا أيضا المسوخ رؤية الزرد ، بما في ذلك أي optokinetic المسوخ (NRC) ردا على ذلك ، الذي كان يعتقد أن يكون أعمى تماما عند اختباره آخر مقايسة الرؤية ، والمنعكس optokin...

Video: A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

الجمع بين المناعي وFISH DNA على الحفاظ على النواة 3D-الطور البيني لدراسة التغيرات في منظمة النووية 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

استخدام رامزي الفحص لقياس إفراز السوائل وايون الجريان الاسعار في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; الأنبوب الصغير مالبيغي

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...