Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de subventions et de santé EY0081 5T32UY07145 et par la Fondation Chevaliers Templiers Eye. Jason Rihel est un Fellow de Bristol-Squibb de la Fondation Life Sciences Research.

Ce protocole décrit les étapes pour effectuer la réponse visuelle-moteur de larves de poisson zèbre à des incréments de la lumière et décréments dans votre propre laboratoire. Le poisson zèbre constituent un système modèle idéal pour des études comportementales. Ils sont faciles à entretenir, ils ont des tailles d&#39;embrayage grandes, et elles se développent rapidement. Par exemple, les yeux des larves de poisson zèbre sont sensibles à la lumière par jour 3 de développement et à laquelle ils présentent une réaction de sursaut. Partie 1: Placage chaque poisson dans une plaque à 96 puits <ol><li> Cultivez larves WT dans un cycle clair / sombre à 28 ° C pendant au moins 4 jours après la fécondation (DPF). Nos typiques de lumière: obscurité du cycle est de 14 heures de lumières sur à partir de 09h00, et 10 heures de lumières, à partir de 23h00. Pour les meilleurs résultats comportementaux, éviter la surpopulation; nous conservons généralement pas plus de 50 larves dans un seul plat de Pétri. </li><li> Après 4 dpf, le poisson zèbre sont prêts à être transférés dans une plaque de 96 puits. Pour donner à la salle de la natation plus de larves, nous utilisons habituellement une plaque de 96 puits avec un bien-grande taille de 650 ul, toutefois, la norme plaques de 96 puits fonctionnent très bien. En utilisant une pipette de transfert en plastique, délicatement le transfert d&#39;une larve par puits. </li><li> Après le transfert des poissons dans les puits, remplir chaque puits avec de l&#39;eau suffisamment de poissons tels que la surface de l&#39;eau est presque au ras de la surface du puits. Soit débordement ou sous-remplissage du bien peut causer des problèmes optiques pour la caméra d&#39;enregistrement. Aussi, prenez garde à ne pas introduire de bulles dans les puits. </li></ol> Partie 2: Enquête sur l&#39;appareil d&#39;enregistrement Pour cette partie du protocole, s&#39;il vous plaît se référer au film afin d&#39;identifier les composants et de vous familiariser avec notre série de l&#39;appareil d&#39;enregistrement. <ol><li> A l&#39;intérieur de la chambre d&#39;enregistrement est un lieu bien défini à la position de la plaque de 96 puits. </li><li> La caméra est positionnée dans le dos et se concentre sur la plaque en utilisant des miroirs de la boîte. L&#39;angle de ces miroirs peut être ajusté en tournant les vis qui maintiennent le miroir en place. </li><li> La chambre d&#39;enregistrement est illuminé par le bas par des diodes infrarouges. Cela permet à l&#39;appareil photo pour voir les poissons, même dans l&#39;obscurité. Les larves ne peuvent pas détecter la lumière infrarouge, donc cette illumination constante IR n&#39;a pas d&#39;incidence de l&#39;expérience. LED blanches éclairent aussi la chambre d&#39;enregistrement d&#39;en bas. Ils sont contrôlés séparément de l&#39;éclairage infrarouge. Eclairer la chambre avec la lumière blanche par-dessus ou sur les côtés est certes possible, mais dans ces cas, des précautions doivent être prises pour éviter une forte éclats de la surface de l&#39;eau qui peuvent interférer avec la caméra. </li><li> Pour les expériences qui durent plus longtemps que quelques heures, remplir la chambre avec un filet d&#39;eau pour aider à maintenir une température constante pendant toute la durée expérimentale. Une façon d&#39;accomplir un flux constant d&#39;eau est de pomper l&#39;eau d&#39;un réservoir par une petite pompe d&#39;aquarium qui est chauffé à 28 ° avec un chauffe-aquarium sous-marin classique. </li><li> Pour minimiser les vibrations parasites de la salle, l&#39;unité d&#39;enregistrement complet doit s&#39;asseoir sur une table bilan lourd. </li></ol> Partie 3: Alignement de la plaque de 96 puits avec la grille informatique de la vidéo-tracking Logiciel <ol><li> Placer la plaque de 96 puits contenant le poisson dans la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Lorsque vous utilisez un bain d&#39;eau, lentement placer la plaque dans l&#39;eau, donnant le niveau de l&#39;eau une chance de s&#39;adapter sans répandre sur la plaque. Sinon, arrêter l&#39;écoulement de l&#39;eau, ajouter la plaque, puis reprendre l&#39;écoulement. Aussi, soyez sûr d&#39;utiliser un ressort ou un élastique pour maintenir la plaque de 96 puits en place. </li><li> Dans le logiciel Videotrack Viewpoint, vérifiez que toutes les larves de votre expérience sont visibles sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. Utilisation des commandes du logiciel, d&#39;aligner la grille des logiciels de vidéo-tracking avec le puits de votre plaque d&#39;telle sorte que chaque poisson est dans un carré de la grille. L&#39;ordinateur de suivi sera calculer le mouvement séparément pour chacune de ces boîtes, donc si vous désaligner la grille informatique certains des mouvements de poissons peuvent être perdues. Ou pire encore: deux poissons adjacents va occuper la même zone et être compté comme un poisson. Cette étape est très importante pour tous vos enregistrements. </li><li> Après l&#39;alignement, le programme du calendrier pour quand les lumières doivent aller sur et en dehors. Nous permettent généralement de 3 heures de l&#39;adaptation clair ou foncé dans la boîte à la fois d&#39;obtenir un niveau d&#39;activité de base, mais aussi pour donner des larves une occasion de se calmer après le pipetage et de manutention. Après le départ, nous avons ensuite alterner avec 30 minutes de lumières sur suivies de 30 minutes de lumières, et de répéter plusieurs fois. </li><li> Ensuite, fermez la porte de la chambre d&#39;enregistrement et de commencer l&#39;enregistrement. </li><li> En pratique, nous enregistrons l&#39;activité de chaque poisson par seconde, mais le logiciel Point de vue, en fait le cadre des dossiers par les données de la trame (voir le filmpour une démonstration de la collecte des données). Réglage de la valeur seuil pour les changements de pixels par image minimale dépendra un peu de votre appareil photo et la configuration particulière de lumière. Pour notre configuration, nous utilisons habituellement un seuil de 4 pixels, c&#39;est, si moins de 4 pixels sont changeantes, il est considéré comme arrière-plan. Si plus de 4 pixels sont en mouvement, il indique que le poisson est en mouvement. Nous empiriquement déterminé que cette coupure détecte presque toutes les larves nagent et les mouvements tour. </li><li> Même si les boîtes d&#39;enregistrement d&#39;isoler les larves assez bien, éteindre la lumière dans la chambre et prendre soin de minimiser les interruptions avec les bruits mécaniques tels que la fermeture et l&#39;ouverture des portes de la salle, une fête de danse, ou en faisant vos routines d&#39;exercice. </li></ol> Partie 4: Analyse des données <ol><li> Après l&#39;expérience est terminée, le transfert des données recueillies dans une feuille Excel ou dans votre suite de l&#39;analyse préférés. </li><li> La feuille Excel ci-joint est un exemple de ce que les données peuvent ressembler: elle contient le temps en secondes depuis le début de l&#39;expérience et l&#39;activité de chaque larve par seconde pour tous les poissons à travers toute l&#39;expérience (voir données complémentaires fichier d&#39;exemple dans la section Fichiers de cette page). </li><li> La figure 1 montre un exemple de l&#39;activité d&#39;une seule larve. La figure 2 est une trace représentative de la moyenne de 40 larves de poisson zèbre WT. La moyenne ON et OFF réponses sont importantes et cohérentes. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="Figure 1" width="569" height="398" /> Figure 1: Activité d&#39;un seul poisson L&#39;activité d&#39;un seul poisson WT à 5 dpf en réponse à une alternance de périodes de 30 minutes de lumière ON et OFF.. Les réponses sur sont indiqués par des flèches noires et les réponses OFF avec les flèches rouges. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="Figure 2" width="577" height="387" /> Figure 2: L&#39;activité moyenne de 40 poissons L&#39;activité moyenne de 40 poissons WT à 5 dpf en réponse à une alternance de périodes de 30 minutes de lumière ON et OFF.. La moyenne ON (flèches noires) et OFF (flèches rouges) les réponses sont importantes et cohérentes. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 3 est un aperçu schématique des lignes expérimentales utilisées dans l&#39;ensemble de nos expériences. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="Figure 3" width="530" height="479" /> Figure 3. La conception expérimentale de la réponse motrice visuelle (VMR) de test. Un poisson) individuels sont placés dans une plaque de 96 puits dans une chambre d&#39;enregistrement. L&#39;activité de chaque poisson est mesurée par seconde. B) les poissons sont donnés une période d&#39;adaptation foncé ou clair de les régler et d&#39;obtenir un niveau d&#39;activité de base. Les périodes d&#39;éclairage de 30 minutes ON et lumières sont introduits de façon consécutive pour un total de 3 heures. Ce diagramme a été adapté à partir Prober et al., 2006. Qu&#39;est-ce que les graphiques réponse visuelle-moteur ressemble? Nous avons mesuré les réponses ON et OFF de poissons WT à des incréments de lumière et décrémente. Pour confirmer que ces réponses ont été dépendante de la fonction des yeux, nous avons mesuré l&#39;activité des mutants chk, qui ne développent pas les yeux. La figure 4 montre l&#39;activité moyenne obtenue à partir d&#39;animaux WT ainsi que les mutants chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="Figure 4" width="489" height="212" /> Figure 4: WT poissons ont clairement ON et OFF des réponses qui sont médiés par les yeux latéraux Le comportement locomoteur des larves de poisson zèbre à 5 dpf en réponse à 30 minutes de lumière et 30 minutes de OFF lumière est enregistrée par seconde.. Chaque trace correspond à une moyenne de 480 réponses individuelles à partir de 120 WT (bleu trace) ou des larves mutantes chk (orange trace) a enregistré plus de 3 expériences. Les mutants chk n&#39;augmentent pas significativement leur activité soit à la lumière par incréments ou décréments et ont un niveau de base faible d&#39;activité. Ce chiffre a été adapté à partir Emran et al., 2007. Visual-Motor Réponses du CNRC poissons mutants. Le mutant du CNRC a été pensé pour être complètement aveugle basée sur le test OKR. Dans le mutant du CNRC, les terminaux photorécepteur ne se forme pas correctement et la voie visuelle Sur est gravement compromise 1. Rétiniennes enregistrements de cellules ganglionnaires de ces poissons mutants a révélé qu&#39;ils présentent majoritairement hors-type des réponses des cellules ganglionnaires, certains anormaux ON-OFF, mais pas purs Sur les réponses de type 2. En utilisant le test VMR, nous avons montré que le mutant CNRC a une normale OFF-réponse et un retard et la lenteur SUR-réponse (SEFigure E 5). Ainsi, le mutant CNRC n&#39;est pas complètement aveugle comme le pensait auparavant 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="Figure 5" width="591" height="244" /> Figure 5: mutats nrc augmenter leur activité en réponse aux changements dans les intensités lumineuses des réponses comportementales à la lumière ON et OFF de WT et le CNRC larves mutantes à 5 dpf.. Chaque trace correspond à une moyenne de 480 réponses provenant de 120 poissons individuels de chaque génotype. Le comportement locomoteur moyenne de mutants du CNRC (traces rose) est légèrement réduite par rapport aux poissons WT (traces bleues), mais reste vigoureuse en suivant la lumière OFF relance. Notez le temps de montée lente dans la réponse du CNRC mutant à la lumière par rapport à la lumière SUR LE réponse du poisson WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

Les procédures expérimentales, nous montrons dans le film sont tous représentatifs de poissons WT. Cependant, ces expériences peuvent être réalisées de façon analogue sur le poisson mutant ainsi (voir la section résultat représentatif). Nous suggérons aux poissons WT plaque et le poisson mutant sur la même plaque dans un aperçu damier à des fins de contrôle optimal. Lors de l&#39;utilisation du poisson mutant sur la même plaque que les poissons WT vous assurer que vous écrivez ce type de poisson a été plaqué dans...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

Le réflexe de optocinétique (OKR) est une base visuelle réflexe exposées par la plupart des vertébrés et joue un rôle important dans la stabilisation de l&#39;oeil par rapport à la scène visuelle. Toutefois, l&#39;OKR exige que l&#39;animal détectez des bandes en mouvement et il est possible que les poissons qui ne parviennent pas à exposer une OKR peut ne pas être complètement aveugle. Un poisson zèbre mutant, l&#39;absence de réponse optocinétique c (CNRC) n&#39;a pas OKR dans n&#39;importe quelles conditions de lumière testé et a été signalé à être complètement aveugle. Auparavant, nous avons montré que l&#39;activité des cellules ganglionnaires OFF peuvent être enregistrées dans ces mutants. Afin de déterminer si le poisson mutant sans OKR tels que le mutant CNRC peut détecter par incréments de lumière simple et décrémente nous avons développé le test de motricité visuelle comportementale (VMR). Dans cet essai, les larves de poisson zèbre simples sont placés dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits permettant la surveillance simultanée des larves en utilisant un système automatisé de vidéo-système de suivi. Les réponses locomotrices de chaque larve à 30 minutes de lumière ON et OFF 30 minutes de lumière ont été enregistrées et quantifiées. WT poissons ont un bref pic d&#39;activité automobile sur les lumières allumées, connue comme la réaction de sursaut, suivi d&#39;un retour plus faibles que l&#39;activité de base, appelé à un gel. Poissons WT également fortement augmenter leur activité locomotrice immédiatement après lumières et que progressivement (plus de quelques minutes) retour à l&#39;activité locomotrice de base. Les mutants du CNRC réagissent de façon similaire à la lumière OFF comme le poisson WT, mais présentent une légère diminution de leur activité en moyenne par rapport aux poissons WT. L&#39;activité motrice en réponse à la lumière ON dans nrc mutants est retardée et léthargique. Il ya un temps de montée lente de la réponse du CNRC mutant à la lumière SUR par rapport à la lumière en poids sur la réponse. Les résultats indiquent que les poissons du CNRC ne sont pas complètement aveugles. Parce que les téléostéens peuvent détecter la lumière à travers la rétine non tissus, nous a confirmé que les réponses immédiates à la lumière du comportement d&#39;intensité changements nécessitent yeux intacts en utilisant le chokh (chk) des mutants, qui manquent totalement les yeux dès les premiers stades de développement. Dans notre test VMR, les mutants ne présentent aucun chk réaction de sursaut soit la lumière ON ou OFF, montrant que les yeux latéraux de médiateur dans ce comportement. Le dosage de VMR décrit ici un complément du dosage OKR bien établie, qui n&#39;a pas de tester la capacité des larves de poisson zèbre pour répondre aux changements dans les intensités lumineuses. De plus, l&#39;automatisation du test VMR se prête à criblage à haut débit pour les défauts de l&#39;intensité lumineuse conduit réponses visuelles.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Nous avons développé la réponse visuelle et de motricité pour quantifier la puissance du moteur du poisson zèbre larvaire dans la réponse aux augmentations de lumière et décrémente. Nous avons également examiné la vision mutants poisson zèbre, y compris le pas de la réponse optocinétique (CNRC) mutants, qui étaient censées être complètement aveugle lorsqu&#39;il est testé par un autre test de vision, le réflexe optocinétique.

Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l&#39;évolution des intensités de lumière

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K vues.  Harvard. Nous avons développé la réponse visuelle et de motricité pour quantifier la puissance du moteur du poisson zèbre larvaire dans la réponse aux augmentations de lumière et décrémente. Nous avons également examiné la vision mutants poisson zèbre, y compris le pas de la réponse optocinétique (CNRC) mutants, qui étaient censées être complètement aveugle lorsqu'il est testé par un autre test de vision, le réflexe optocinétique.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections intraveineuse de larves de poisson zèbre pour étudier lésions rénales aiguës

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Recherche

Biologie

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Immunofluorescence quantitative pour mesurer la variation des taux de protéines au centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Méthode d&#39;évaluation des effets d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

L&#39;utilisation du test Ramsay mesurer la sécrétion de liquide et de flux d&#39;ions dans le Tarifs<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubule Malpighian

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Essai in vitro pour mesurer Phosphatidyléthanolamine Methyltransferase activité

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...