עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים EY0081 ו 5T32UY07145 ועל ידי קרן האבירים הטמפלרים העין. ג&#39;ייסון Rihel הוא עמית Bristol-Squibb של מדעי החיים Research Foundation.

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי לבצע את תגובת חזותי מוטורי זחלים של דג הזברה כדי במרווחים ו decrements אור במעבדה שלך. דג הזברה הם מערכת מודל נהדר עבור מחקרים התנהגותיים. הם קל לשמור, הם גדלים המצמד גדולים, הם מתפתחים מהר. לדוגמה, עיניו של דג הזברה הזחלים מגיבים לאור יום 3 הפיתוח בו בזמן הם מפגינים תגובת בהלה. חלק 1: ציפוי דגים בודדים לתוך צלחת 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל זחלים WT תחת מחזור אפל / אור 28 ° C עד הפריה ימים לפחות 4 פוסט (DPF). אור אופייני שלנו: כהה מחזור הוא 14 שעות של האורות החל מהשעה 09:00, ו - 10 שעות של האורות, החל בשעה 11:00. לקבלת התוצאות הטובות ביותר התנהגותיים, למנוע צפיפות, אנחנו בדרך כלל לשמור על לא יותר מ 50 זחלים בצלחת פטרי אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DPF 4, דג הזברה מוכנים יועברו לתוך צלחת 96-היטב. כדי לתת יותר מקום הזחלים שחייה, אנו משתמשים בדרך כלל צלחת 96-היטב עם גודל היטב גדול של 650 μl, עם זאת, תקן 96, גם צלחות עובד בסדר גמור. שימוש pipet העברת פלסטיק, בעדינות העברה חד הזחל לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברת דגים לתוך בארות, למלא בכל טוב עם דגי מים מספיק כך את פני השטח מים לשטוף כמעט לחלק העליון של בארות. או שגדשו או underfilling היטב יכול לגרום לבעיות אופטי למצלמה ההקלטה. כמו כן, לדאוג לא להכניס בועות לתוך בארות. </li></ol> חלק 2: סקר של מנגנון הקלטה עבור חלק זה של הפרוטוקול, עיין הסרט כדי לזהות רכיבים היכרות עם סט שלנו את מנגנון ההקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך חדר הקלטה הוא מקום מוגדר היטב למצב צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצלמה ממוקמת בגב מתמקדת הצלחת באמצעות מראות את הקופסה. הזווית של מראות אלה יכול להיות מותאם על ידי סיבוב הברגים שמחזיקים את המראות במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר הקלטה מואר מלמטה על ידי נוריות אינפרא אדום. זה מאפשר את המצלמה כדי לראות את הדגים אפילו בחושך. הזחלים אינם יכולים לגלות אור אינפרא אדום, אז זה תאורה קבועה IR אינו משפיע על הניסוי. לבן נוריות גם להאיר את תא הקלטת מלמטה. הם נשלטים בנפרד את האורות IR. מאירים את החדר באור לבן מלמעלה או מן הצדדים בהחלט אפשרי, אולם במקרים אלה, יש להקפיד להימנע חזק נועץ את פני המים שעשויים להפריע המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניסויים לאחרונה יותר כמה שעות, למלא את התא בעדינות עם מים זורמים כדי לעזור לשמור על טמפרטורה קבועה למשך תקופת הניסוי. אחת הדרכים להשיג זרם קבוע של מים כדי לשאוב מים ממאגר ידי משאבה באקווריום קטן מחוממת ° 28 עם חימום באקווריום טיפוסי מתחת למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער רטט תועה מחדר, יחידת הקלטה כולו צריך לשבת על גבי שולחן איזון כבד. </li></ol> חלק 3: יישור הצלחת 96-היטב עם רשת המחשבים של מעקב וידאו תוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 96-היטב המכיל את הדגים לתוך תא ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת השימוש באמבט מים, לאט לאט המקום הצלחת במים, נותן את מפלס המים הזדמנות להתאים מבלי לשפוך לצלחת. לחילופין, לכבות את זרימת המים, להוסיף את הצלחת, ולאחר מכן לחדש את הזרימה. כמו כן, הקפד להשתמש קפיץ או גומייה כדי להחזיק את הצלחת 96-היטב במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה Videotrack Viewpoint, לבדוק כי כל הזחלים של הניסוי שלך נראים על מסך המחשב. שימוש בפקדים של התוכנה, ליישר את הרשת של תוכנות מעקב וידאו עם בארות של צלחת כזו דגים בתוך כל ריבוע של הרשת שלך. מחשב מעקב יהיה חישוב תנועה בנפרד לכל אחת הקופסאות האלה, אז אם אתם misalign רשת מחשב כמה תנועות דגים עלולים ללכת לאיבוד. או אפילו יותר גרוע: שני דגים סמוך יתפוס את השטח אותו להיות נחשב דג אחד. שלב זה חשוב מאוד עבור כל הקלטות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היישור, התוכנית עיתוי כאשר האורות צריך ללכת לסירוגין. אנחנו בדרך כלל מאפשרים 3 שעות של הסתגלות אור או חושך בתיבת הן להשיג רמת הפעילות הבסיסית, אלא גם לתת את הזחלים הזדמנות להירגע בעקבות pipetting והטיפול. אחרי ההתחלה, אנחנו חלופי אז עם 30 דקות של אורות ואחריו 30 דקות של האורות, וחזור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לסגור את הדלת של החדר הקלטה להתחיל בהקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפועל, אנחנו מתעדים את הפעילות של כל דג לשנייה, אבל את התוכנה Viewpoint למעשה מתעדת את מסגרת מסגרת על ידי נתונים (עיין הסרטלהפגנה של איסוף הנתונים). קביעת ערך סף של שינוי פיקסל מינימום לכל מסגרת יהיה תלוי במידה מסוימת על המצלמה הספציפית שלך ואת ההתקנה קלה. עבור ההתקנה, אנו משתמשים בדרך כלל סף של 4 פיקסלים, כלומר, אם פחות מ 4 פיקסלים משתנים, זה נחשב רקע. אם יותר מ 4 פיקסלים זזים, זה מצביע על דג נע. אנחנו נקבע באופן אמפירי, כי הפסקת זה מזהה כמעט את כל הזחל לשחות ותנועות לפנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות תיבות הקלטה לבודד את הזחלים די טוב, לכבות את האור בחדר ולטפל כדי למזער הפרעות עם רעש מכני כגון סגירת ופתיחת דלתות בחדר, לאחר מסיבת ריקודים, או עושה לממש שגרות שלך. </li></ol> חלק 4: ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי הושלם, להעביר את הנתונים שנאספו לתוך גיליון Excel או לתוך הסוויטה ניתוח האהוב עליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גיליון Excel המצורף הוא דוגמא למה הנתונים עשוי להיראות כך: הוא מכיל את הזמן בשניות מתחילת הניסוי את הפעילות של כל זחל בכל שניות לכל הדגים לאורך הניסוי כולו (ראו קובץ משלים נתונים דוגמה ב קבצים בסעיף של דף זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איור 1 מציג דוגמה לפעילות של זחל אחד. איור 2 הוא זכר נציג הממוצע של הזחלים WT 40 דג הזברה. בממוצע ON ותגובות OFF בולטים ועקבית. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_9/923_Figure-02.png" alt="איור 1" width="569" height="398" /> איור 1: פעילות של דג בודד הפעילות של דג WT יחיד DPF 5 בתגובה לסירוגין תקופות של 30 דקות קל לסירוגין.. התגובות ON מסומנים על ידי חצים שחורים התגובות OFF עם החצים האדומים. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_11/923_Figure-03.png" alt="איור 2" width="577" height="387" /> איור 2: פעילות ממוצע של דגים 40 הפעילות הממוצעת של דג 40 WT ב DPF 5 בתגובה לסירוגין תקופות של 30 דקות קל לסירוגין.. בממוצע ON (חיצים שחורים) ו OFF (חצים אדומים) תגובות בולטים ועקבית. </li></ol> 5. נציג תוצאות איור 3 הוא מתאר סכימטי של המתאר את הניסוי השתמשו בכל הניסויים שלנו. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_12/923_Figure-04.png" alt="איור 3" width="530" height="479" /> איור 3. עיצוב ניסיוני של בדיקה חזותית תגובה (VMR) מוטור. דג) הפרט ממוקמים צלחת 96-היטב בתא ההקלטה. הפעילות של דגים כל נמדד בשנייה. ב) דגים מקבלים תקופה של הסתגלות כהה או בהיר כדי ליישב אותם כדי להשיג רמת הפעילות הבסיסית. תקופות של 30 דקות על אורות ואורות OFF מוצגים ברצף עבור סכום כולל של 3 שעות. תרשים זה הותאם מ Prober et al. 2006. מה לעשות של Visual-Motor גרפים תגובת נראה? מדדנו את התגובות לסירוגין של דגים WT כדי במרווחים ו decrements אור. כדי לאשר תגובות אלה היו תלויים לפעולת העין, מדדנו את הפעילות של מוטנטים chk, אשר אינם מפתחים כל העיניים. איור 4 מראה את הפעילות הממוצע המתקבל חיות WT כמו גם מוטנטים chk. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_13/923_Figure-05.png" alt="איור 4" width="489" height="212" /> איור 4: דגים WT יש לנקות ולכבות התגובות הן בתיווך העיניים לרוחב ההתנהגות של תנועה של זחלים דג הזברה ב DPF 5 בתגובה 30 דקות של אור ו 30 דקות של OFF אור נרשם לשנייה.. עקבות מייצגת ממוצע של 480 תגובות מתוך 120 WT הפרט (כחול זכר) או זחלים chk מוטציה (כתום זכר) נרשם על 3 ניסויים. מוטנטים chk לא להגדיל באופן משמעותי את פעילותם או במרווחים או decrements אור יש רמה בסיסית נמוכה של פעילות. נתון זה הותאם מ Emran et al. 2007. חזותית, מנוע התגובות מהדג NRC מוטציה. מוטציה בקמ&quot;ג נחשב עיוור לחלוטין על פי מבחן OKR. ב מוטנטים NRC, מסופי photoreceptor לא יוצרים כראוי על מסלול הראייה נפגעת קשות 1. רשתית תא גנגליון הקלטות דגים מוטנטים אלה עולה כי הם מפגינים בעיקר off-סוג תא גנגליון התגובות, כמה חריגות ב-off, אבל לא טהור ב-type 2 תגובות. באמצעות מבחן VMR הראינו כי מוטציה NRC יש נורמלי OFF-התגובה עיכוב איטית על התגובה (seדואר איור 5). לפיכך, מוטציה NRC אינה עיוורת לחלוטין כפי שסברו קודם לכן 2. <img src="/files/ftp_upload/old/923_2008_9_26_14/923_Figure-06.png" alt="איור 5" width="591" height="244" /> איור 5: mutats NRC להגדיל את הפעילות שלהם בתגובה לשינויים בעוצמות אור תגובות התנהגותיות להדליק ולכבות מ WT וזחלים NRC מוטציה ב DPF 5.. עקבות מייצגת ממוצע של 480 תגובות מתוך 120 דגים בודדים גנוטיפ אחד. ההתנהגות של תנועה ממוצעת של מוטנטים NRC (עקבות ורוד) מצטמצם מעט לעומת דגים WT (עקבות כחול) אבל עדיין נמרץ בעקבות האור OFF גירוי. הערה הזמן עלייה איטית בתגובה NRC מוטציה לאור ON לעומת אור על התגובה של הדג WT.

<ol>
	<li>Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+is+arrested+in+retinal+photoreceptors+of+the+zebrafish+nrc+mutant.">Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant.</a> J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OFF+ganglion+cells+cannot+drive+the+optokinetic+reflex+in+zebrafish.">OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).</li><li>Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypocretin/orexin+overexpression+induces+an+insomnia-like+phenotype+in+zebrafish.">Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish.</a> J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).</li></ol>

הפרוצדורות אנחנו מראים בסרט הם כל נציג של דגים WT. עם זאת, הניסויים הללו ניתן לעשות זאת באנלוגיה על דגים מוטנטים, כמו גם (ראה סעיף נציג תוצאה). אנו ממליצים על צלחת דגים WT דגים מוטנטים על הצלחת באותו מתווה לוח דמקה למטרות שליטה אופטימלית. בעת שימוש דגים מוטנ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microplate devices</td>
<td>Tool</td>
<td>Whatman</td>
<td>7701-1651</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipetes</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>202205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish water</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>refer to reference #4</td>
</tr>
<tr>
<td>Recording chambers (Zebrabox)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Videotrack Software</td>
<td>Tool</td>
<td>Viewpoint Lifesciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities 

רפלקס optokinetic (OKR) היא של Visual Basic רפלקס הוצגו על ידי רוב בעלי החוליות ואת ממלא תפקיד חשוב בייצוב עין יחסית למקום חזותית. עם זאת, OKR מחייב חיה לזהות פסים נעים יתכן כי דגים אינם תערוכה OKR לא יכול להיות עיוור לחלוטין. דג הזברה מוטציה אחת, תשובה ג optokinetic (NRC) אין OKR בכל תנאי אור נבדק נמסר להיות עיוור לחלוטין. בעבר הראינו כי OFF-הגנגליון פעילות התא יכול להיות מוקלט מוטנטים אלו. כדי לקבוע אם דגים מוטנטים עם OKR אין כמו מוטציה NRC יכול לזהות במרווחים של אור פשוט decrements פיתחנו את assay חזותי מנוע התנהגותיות (VMR). ב assay זה, זחלים דג הזברה יחיד ממוקמים היטב בכל צלחת 96-היטב המאפשר ניטור סימולטני של הזחלים באמצעות מערכת אוטומטית, מעקב וידאו. התגובות של תנועה של כל זחל עד 30 דקות אור ו -30 דקות את האור הוקלטו לכימות. דגים WT יש עלייה קצרה של פעילות מוטורית על האורות דולקים, המכונה תגובת בהלה, ואחריו לחזור נמוכה מאשר פעילות המחקר, שנקרא להקפיא. דגים WT גם להגביר את הפעילות של תנועה חדה שלהם מיד לאחר כיבוי האורות, ורק בהדרגה (מעל מספר דקות) לחזור לפעילות בסיסית של תנועה. מוטנטים NRC להגיב באופן דומה אור OFF כמו דג WT, אבל התערוכה ירידה קלה בפעילות הממוצעת שלהם לעומת דגים WT. פעילות מוטורית בתגובה אור ב NRC מוטנטים מתעכב ועכור. יש זמן עלייה איטית של התגובה NRC מוטציה לאור ON לעומת אור WT על התגובה. תוצאות המחקר מראות כי דגים NRC אינם עיוורים לגמרי. מכיוון teleosts יכול לזהות אור דרך אי - רשתית רקמות, אנו אישר כי תגובות התנהגותיות מיידית אור עוצמת השינויים דורשים עיניים שלם באמצעות (chk) מוטנטים chokh, אשר לחלוטין חוסר העיניים החל מהשלבים המוקדמים של הפיתוח. ב assay VMR שלנו, מוטנטים chk התערוכה אין תגובת בהלה לאור או כבוי, מראה כי בעיני לרוחב לפשר התנהגות זו. Assay VMR המתואר כאן משלים את assay ומבוססת OKR, אשר אינו לבחון את היכולת של הזחלים דג הזברה להגיב לשינויים בעוצמות אור. בנוסף, אוטומציה של assay VMR ניתנת ההקרנה תפוקה גבוהה עבור פגמים עוצמת אור מונע תגובות חזותית.

Watch this Scientific Journal Video about A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities at JoVE.com

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

a-behavioral-assay-to-measure-responsiveness-zebrafish-to-changes

Research

JoVE Journal

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

16.2K Views.  Harvard. פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.

Video: A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The Drosophila&#160;melanogaster Malpighian (renal) tubule offers an unparalleled opportunity to study the molecular mechanisms of epithelial ion transport, due to the powerful genetics of this organism and the accessibility of its renal tubules to physiological study. Here, we describe the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated fly renal tubules, with the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid. This assay allows study of transepithelial fluid and ion fluxes of ~20 tubules at a time, without the need to transfer the secreted fluid to a separate apparatus to measure ion concentrations. Genetically distinct tubules can be analyzed to assess the role of specific genes in transport processes. Additionally, the bathing saline can be modified to examine the effects of its chemical characteristics, or drugs or hormones added. In summary, this technique allows the molecular characterization of basic mechanisms of epithelial ion transport in the Drosophila tubule, as well as regulation of these transport mechanisms.

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

This protocol describes the use of the Ramsay assay to measure fluid secretion rates from isolated Malpighian (renal) tubules from Drosophila melanogaster. In addition, the use of ion-specific electrodes to measure sodium and potassium concentrations in the secreted fluid, allowing calculation of transepithelial ion flux, is described.

שימוש של assay רמזי כדי למדוד את הפרשת נוזלים ויון שטף מחירים ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; אבובית Malpighian

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...