ونيوزيلندي أود أن أشكر أعضاء مختبر سوبهاس بيسواس ، سبرول أندرو ، ويليت ريان على تدريبها في تشريح وحصاد الخلايا العصبية المتعاطفة. بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، NINDS.

1. التحضير للتشريح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد طبق الثقافة المناسبة (10 سم أو 6 لوحات جيدا أو جيدا 24 ، الخ.) تبعا لطبيعة من التجارب الخاصة بك ، ومعطف لهم ذيل فأر 24 ساعة قبل تشريح الكولاجين. وقد وصفت وسائل لاعداد الجرذان ذيل الكولاجين واستخدامها لأطباق معطف الثقافة في مكان آخر (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل التربسين 0.25 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (بدون EDTA) وفلتر تعقيم. 1 مل aliquots إعداد وتخزين -20 درجة مئوية في C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول يحتوي على 2.5 ملي كل من يوريدين و 5 في FDU المقطر / منزوع الأيونات H 2 O. فلتر تعقيم وتجهيز 50 aliquots ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متوسطة أكمل : RPMI مستنبت 1640 مع المعطل للحرارة بنسبة 10 ٪ مصل الحصان (الحرارة التي يحتضنها تعطيل في بالحمام المائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متوسطة النهائي : RPMI مستنبت 1640 مع الحرارة المعطل 1 ٪ الحصان المصل + NGF (100ηg/ml التركيز النهائي) + البنسلين / الستربتوميسين (1 / 250) + حل uridine/5-FDU 1 / 250 (10 ميكرومتر تركيز النهائي) . ملاحظة : ينبغي بذل هذه الوسيلة الجديدة حتى قبل استخدامها في كل مرة. عن تجربة في شكل لوحة 24 جيدا ، وسوف يحتاج المرء لإعداد 12 مل من هذا المتوسط. فمن المستحسن أن تقوم بإعداد قليلا اضافية. يمكن شراؤها NGF من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية (انظر الجدول في نهاية هذا البروتوكول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعدات : واحد سوف تحتاج إلى مجهر تشريح ومصدر الضوء. ويفضل من الألياف البصرية معقوفة منار المزدوجة مع نصائح التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يحتاج المرء لتنظيف وتعقيم (عن طريق التعقيم أو تمرغ في الايثانول 70 ٪ على الأقل 20 دقيقة) وأدوات تشريح التالية : زوجين من الدقيقة تشريح ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ ، وزوج من مقص تشريح (أيضا الفولاذ المقاوم للصدأ وكلاهما من Roboz). وسيتم أيضا اثنين من إبر المحاقن المعقمة (26 × 1 gague ½ بوصة أو ما شابه) تكون هناك حاجة. فمن الضروري لاقامة مجلس تشريح ، وهو 3 &quot;X3&quot; قطعة من الستايروفوم ملفوفة بورق الألمنيوم ومغطاة Kimwipe. رذاذ متنها الإيثانول 70 ٪ لتطهير. أخيرا ، تعد لإطلاق النار الزجاج المصقول المراعي ماصة. من أجل تلميع إطلاق النار ، واتخاذ ماصة الزجاج وعقد قمة في لهب لبضع ثوان ، في حين تناوب. عند التفتيش ، وسوف تبدو أكثر سلاسة غيض وفتح ستكون أضيق. هذه هي خطوة ضرورية لخلايا حيث سيتم فصلها. أداء النار تلميع في خلية غطاء الثقافة بحيث يبقى ماصة معقمة. </li></ol> 2. تشريح العقد العنقية العليا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الجراء الفئران حديثي الولادة التي هي في سن أو P0 P1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح بسرعة الجرو لتشريح الايثانول مع 70 ٪ لتقليل فرص التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجرو بسرعة مع زوج من مقص حاد (لن تكون هذه الخطوة تظهر في شريط الفيديو). عقد رئيس باستخدام ملقط معقم ضد شاش معقم لاستنزاف الدم لفترة وجيزة الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رأسه على الوسادة تشريح مع الجانب البطني مواجهة ونهاية الذيل موجهة نحوك. يجب قطع القصبة الهوائية تكون مرئية بسهولة. استخدام إبر المحاقن المعقمة لتأمين رأس مقطوع لوحة تشريح على النحو التالي : دفع one دبوس على الرغم من أن سقف الفم في لوحة ودفع دبوس الثاني رغم قطع القصبة الهوائية في لوحة. وضع وسادة تحت المجهر تشريح والبدء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كل ملقط (واحدة في كل يد) الجلد واضحة بعيدا والدهون حول القصبة الهوائية ، مع الحرص على عدم ذهاب عميقا جدا. وسوف نفعل ذلك يعرض زوج من العضلات مواز تقريبا لبعضها البعض على جانبي القصبة الهوائية. ملاحظة : أثناء تشريح ، سوف تحتاج إلى ري مع برنامج تلفزيوني العقيمة الباردة أو باردة ، 1640 مصل مجانا RPMI المتوسطة تسليمها مع ماصة معقمة باستور ، ليغسل الدم الزائد وإبقاء المنطقة نظيفة ورطبة. ويمكن القيام بذلك إلا مرة واحدة أو أكثر من مرة تبعا لمدى سرعة واحد يعمل. لمشرح الخبرة ، فإنه يأخذ فقط حوالي 2-3 دقائق لتشريح من زوج من العقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لقطع وإزالة العضلات على جانب واحد أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد إزالة العضلات ، والشريان السباتي تصبح مرئية. غالبا ما يكون وردي خفيف ويحتوي على الدم. قد يبدو أفتح لونا من الأوعية الدموية الأخرى التي قد ترى في محيط ، ولهذا السبب الشريان السباتي قد لا يكون ملحوظا على الفور. هذا الشريان يعمل جنبا إلى جنب مع القصبة الهوائية وbifurcates الى ما يشبه &quot;Y&quot; على شكل شريط. هذا التشعب يشكل معلما هاما ويقع مرة واحدة ، فإنه سيكون من السهل نسبيا العثور على SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشريان في نهاية معظم الذيلية ورفعه ارتفاعا طفيفا مع ملقط (لا يزال مربوطا الطرف الآخر). بمجرد القيام بذلك ، سوف تشاهد لوزية الشكل ، لامعة كتلة صغيرة من الأنسجة التي تبحث هي فضفاضة يعلق على الشريان فقط في نقطة والتشعب الذي عبتيEAD مثل قبل و- / أو آخر ، connectives العقدية. هذه هي العقدة متفوقة عنق الرحم. استخدام ملقط من الزوج الثاني في اليد الأخرى لفصل برفق ومكان في صحن الثقافة الصغيرة (35 مم) التي تحتوي على والمصل الباردة مجانا RPMI 1640 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، استخراج عقدة على الجانب الآخر من القصبة الهوائية بعد بروتوكول نفسه. </li></ol> 3. تنظيف العقد : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تشريح كل من العقد ، ينبغي الافراج عنهم قدر المستطاع من الأنسجة دخيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، قد ترى أن العقد قد تعلق قطعة من الشريان السباتي ، والأنسجة الدهنية أو غيرها. العمل مع ملقط في كل يد لندف بعيدا هذه المواد غير المرغوب فيها. تنظيف مكان العقد الى المخروطية 15ml العقيمة ، أنبوب البولي بروبيلين ، وتحتوي على 1640 RPMI المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أيضا connectives قبل و / أو العقدية آخر ، يتم قطع بعيدا. كل عقدة لديها نحو 10000 الخلايا العصبية. حالما يتم مطلي الخلايا العصبية ، فإنها تنمو neurites بهم. </li></ol> 4. تأسيس ثقافة متعاطف الخلية العصبية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العقد في 200xg لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend على العقد في 0،5-1 مل من محلول التربسين 0.25 ٪. مكان بالحمام المائي في 37 ˚ C أو حاضنة لمدة 30 دقيقة. وهذا سيساعد على فصل الخلايا في العقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة ، وإضافة 10 مل من متوسطة إلى كاملة لتخفيف وتحييد التربسين والطرد المركزي في 200xg لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف resuspend في 2 مل من متوسطة النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا عن طريق زيادة الطحن في العقد صعودا وهبوطا مع اطلاق النار من الزجاج المصقول ماصة المراعي. يسحن في العقد 20 مرة ، ووضع أنبوب على الجليد لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، النار تلميع أكثر ماصة لجعل فتح أضيق (حوالي 2 / 3 إلى 1 / 2 مليمتر في القطر). انتظر بضع دقائق حتى يبرد ويسحن في العقد 20 مرة أكثر من ذلك. كما قمت بالمتابعة ، سوف تصبح تدريجيا المتوسطة مشيرا إلى أن الخلايا cloudier يتم فصلها. كرر هذه الخطوة مرة أو مرتين أكثر اعتمادا على مدى فصل الخلايا. بعد بعض الوقت ، ستلاحظ أن جميع العقد قد نأت الى الخلايا العصبية والعقد ليس سليما واضحة في الأنبوب. قد يكون هناك بعض المواد الأنسجة التي لن تنفصل. عند هذه النقطة ، والسماح للأنبوب الجلوس في الثلج لبضع دقائق حتى أن أي تسوية يمكن أن الحطام undissociated إلى أسفل. الآن بعناية جمع ما يقرب من جميع المتوسط ​​من أعلى مكان ، وآخر في الأنبوب. لضمان أن لا جمع الحطام undissociated ، وترك نحو 50 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة أكثر من المتوسط ​​النهائي للأنبوب التي تحتوي على الخلايا تنفصل : هذا الحجم يعتمد على نوع من ثقافة واحدة لوحة يستخدم للثقافة الخلايا العصبية. على سبيل المثال : إذا طبق بشكل جيد هو 24 لاستخدامها ، ثم لوحة العقد 0،5 لكل بئر (~ 10000 الخلايا العصبية لكل بئر) في 0.5 مل من المتوسط ​​النهائي لكل بئر. أ القمامه الفئران نموذجية تتكون من 12 الجراء ، والتي ستعطي العقد 24. هذا هو ما يكفي لوحة البذور 24 واحد وكذلك إجمالي حجم متوسط ​​النهائي هو 12 مل. ملاحظة : في العقد تحتوي أيضا على عدد صغير من السكان من أنواع الخلايا الدبقية ، والأخرى التي ستكون حاضرة في الثقافة. وسوف تستخدم في المتوسط ​​Uridine/5-FDU النهائي منع انتشارها وتعزيز وفاتهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الخلايا كل 48 ساعة عن طريق استبدال 2 / 3 من وسيلة جديدة مع RPMI +1 ٪ الحصان NGF + المصل وuridine/5-FDU. ملاحظة : في البداية ، وثقافة يحتوي على الخلايا العصبية التي تبدو متعاطفة مع عدم وجود جولة neurites. neurites قصيرة تصبح مرئية بعد 24 ساعة من تشريح وتصبح تدريجيا أكثر كثافة وأكثر بمرور الوقت تشعبت. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways.">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li><li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nerve+Growth+Factor:+purification+as+a+30,000-molecular-weight+protein.">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li><li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chat+in+the+Trophic+Web:+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling.">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li><li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development.">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+(NGF)+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons.">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li><li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents.">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).</li><li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways.">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نستخدم سبراغ داولي الفئران لثقافاتنا. يستغرق وقتا طويلا والحذر عند تنظيف العقد. إزالة جميع السفن الحطام في الدم ، والدهون. هذه الخطوة هامة في ضمان وجود الثقافة التي هي أكثر أو أقل متجانسة وخالية من أنواع الخلايا الدخيلة. وإضافة إلى حد كبير uridine/5-FDU القضا...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps, Stainless steel #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4976</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 w/ L-Glutamin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
<td>10-040-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>12103c</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donor Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>JRH Biosciences</td>
<td>12449</td>
<td>Heat-inactivate by incubating in 56&deg;C waterbath for 30 minutes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco, Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin without EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Difco</td>
<td>MT 25-050-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>U3003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Fluoro-5' deoxyuridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>F-8791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Harlan Bioproduct</td>
<td>BT-5025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Microscope and light source</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml polypropylene tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell culture dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning, Nunclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (scg)

في العقد متفوقة عنق الرحم (SCG) في الفئران ، لامعة صغيرة ، لوزية الشكل الهياكل التي تحتوي على الخلايا العصبية المتعاطفة. هذه الخلايا العصبية توفير innervations متعاطفة عن الرأس والعنق والمناطق التي يشكل عدد سكانها جيدا ، وتتميز متجانسة نسبيا (4). الخلايا العصبية المتعاطفة تعتمد على عامل نمو الاعصاب (نيسان الخليج) لتحقيق النمو والبقاء التمايز والمحاور وانتشرت على نطاق وتوافر NGF يسهل ثقافتهم والتلاعب التجريبية (2 ، 3 ، 6). لهذه الأسباب ، فقد تم استخدام الخلايا العصبية المتعاطفة مثقف في طائفة واسعة من الدراسات بما في ذلك تطوير الخلايا العصبية والتفرقة ، وآليات للموت الخلايا المبرمج والمرضية ، ونقل الإشارة (1 ، 2 ، 5 ، و 6). تشريح خارج SCG من الفئران حديثي الولادة وزراعة الخلايا العصبية المتعاطفة ليست معقدة للغاية ويمكن أن تتقن بسرعة إلى حد ما. في هذه المقالة ، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تشريح خارج SCG من الفئران الوليدة الوليد واستخدامها لإنشاء الثقافات من الخلايا العصبية المتعاطفة. وتصف المقالة أيضا الخطوات التحضيرية والكواشف والمعدات المختلفة التي يحتاجها لتحقيق ذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG at JoVE.com

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

هذا هو بروتوكول تصف كيفية عزل الخلايا العصبية والثقافة متعاطفة الأساسي من العقد العنقية العليا (SCG) من الفئران الوليدة الوليد.

بروتوكول للالخلايا العصبية التثقيف تعاطفية من العقد الجرذ عنق الرحم فخمة (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

22.7K Views.  Columbia University. هذا هو بروتوكول تصف كيفية عزل الخلايا العصبية والثقافة متعاطفة الأساسي من العقد العنقية العليا (SCG) من الفئران الوليدة الوليد.

Video: Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

العدلة عزل بروتوكول

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

إعداد وصيانة الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في الثقافات Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A بروتوكول بسيط لاستخراج اليرقات من Hemocytes البرية

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP binds to vasopressin V2 receptors (V2R) on the surface of the cells and thereby induces synthesis of cAMP. This stimulates cellular signaling processes leading to changes in the phosphorylation of the water channel aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 and thereby triggers the translocation of AQP2 from intracellular vesicles into the plasma membrane facilitating water reabsorption from primary urine. Aberrations of AVP release from the pituitary or AVP-activated signaling in principal cells can cause central or nephrogenic diabetes insipidus, respectively; an elevated blood plasma AVP level is associated with cardiovascular diseases such as chronic heart failure and the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion.
Here, we present a protocol for cultivation of primary rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells, which express V2R and AQP2 endogenously. The cells are suitable for elucidating molecular mechanisms underlying the control of AQP2 and thus to discover novel drug targets for the treatment of diseases associated with dysregulation of AVP-mediated water reabsorption. IMCD cells are obtained from rat renal inner medullae and are used for experiments six to eight days after seeding. IMCD cells can be cultured in regular cell culture dishes, flasks and micro-titer plates of different formats, the procedure only requires a few hours, and is appropriate for standard cell culture laboratories.

Arginine-vasopressin (AVP) controls fine-tuning of body water homeostasis through facilitating water reabsorption by renal principal cells. Here, we present a protocol for the cultivation of primary rat inner medullary collecting duct cells suitable for the elucidation of molecular mechanisms underlying AVP-mediated water reabsorption.

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

أخذ عينات الدم من الوريد الذيل الأفقي من الفئران

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle biopsies are often collected for these endeavors. However, relatively few technical descriptions of biopsy procedures, outside of the commonly used musculus vastus lateralis, are available. Although the biopsy techniques are often adjusted to accommodate the characteristics of each muscle under study, few technical reports share these changes to the greater community. Thus, muscle tissue from human participants is often wasted as the operator reinvents the wheel. Expanding the available material on biopsies from a variety of muscles can reduce the incident of failed biopsies. This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique on the musculus tibialis anterior that limits fiber damage and provides fiber lengths adequate for mechanical evaluation. The surgery is an outpatient procedure that can be completed in an hour. The recovery period for this procedure is immediate for light activity (i.e., walking), up to three days for the resumption of normal physical activity, and about one week for wound care. The extracted tissue can be used for mechanical force experiments and here we present representative activation data. This protocol is appropriate for most collection purposes, potentially adaptable to other skeletal muscles, and may be improved by modifications to the collection needle.

This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique for the biopsy of the musculus tibialis anterior that limits fiber damage.

جمع خزعات العضلات الهيكل العظمى من المقصورة العليا من الإنسان Musculus Tibialis الأمامي للتقييم الميكانيكي

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...