ganglion الدجاج ciliary، هو هيكل موضعية في الجزء الخلفي من العين، المتاخمة للعصب البصري في شق المشيمية. والخلايا العصبية العقدية ciliary، تنتمي إلى الجهاز العصبي الطفيلي، والخلايا العصبية الكولينية، وبالتالي فإنها يمكن أن تشكل نقاط الاشتباك العصبي cholinergic. ganglion ciliary يتكون من مجموعة هائلة من الخلايا العصبية الهدجي والخلايا العصبية المشيمية، التي هي متميزة هيكليا ووظيفيا.
حتى الخلايا العصبية ciliary اغراء العضلات داخل العين، والخلايا العصبية المشيمية اغراء العضلات المزاج في العين. وفي الأيام الأولى في الثقافة، تقدم الخلايا العصبية العقدية الهجبي مورفولوجيا متعددة الأقطاب، وبعد هذه، تبدأ في الانتقال إلى حالة أحادية القطب، حيث تمتد واحدة من نيوريت وتشكل محور عصبي. واحدة من الدراسات الأكثر شيوعا باستخدام الخلايا العصبية العقدية الهجل، هو دراسة نقاط الاشتباك العصبي العصبي العضلي، والتي هي نقاط الاشتباك العصبي الكولليني، واستخدام الخلايا العصبية العقدية الهجلى أصبح بديلا جيدا، مقارنة بالنماذج السابقة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن السكان العصبيين التي تم الحصول عليها، متجانسة بمعنى أن جميع الخلايا العصبية هي cholinergic، وبالتالي فإنها يمكن أن تنشئ نقاط الاشتباك العصبي الوظيفي مع خلايا العضلات ، وهو ما لا يحدث عندما نعمل مع السكان العصبية، وهذا ليس الكولينيني تماما.
تحديد وتشريح من ganglion ciliary يمكن أن يكون تحديا كبيرا لشخص ما القيام بذلك للمرة الأولى، لذلك هنا نقدم خطوة بخطوة البروتوكول، لتحديد المناسبة وتشريح من العقدة ciliary، فضلا عن المبادئ التوجيهية للثقافة الناجحة لهذه الخلايا العصبية. لإعداد الأغطية، وسوف تحتاج، 13 ملليمتر الزجاج الأغطية، وحاوية مقاومة للحامض، 65٪ حمض النيتريك، ملاقط، المياه ميلي-كيو، 75٪ الإيثانول وشاك المداري. إعداد الأغطية للثقافات الأولية، ينبغي أن يتم قبل يومين من الإجراء.
ضع العدد المطلوب من الأغطية الزجاجية ، داخل حاوية مقاومة للأحماض ، وأضف حمض النيتريك بنسبة 65٪، حتى يتم تغطية جميع الأغطية. ضع الحاوية في شاكر مداري، واحتضانها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الهياج. في اليوم التالي، وإزالة بعناية حمض النيتريك، ونجمة لإعادة استخدامها.
غسل الأغطية، إضافة المياه ميلي-Q إلى الحاوية. مرة أخرى، وضع الانفعالات لمدة 30 دقيقة، والتخلص من محلول الغسيل، وتكرار هذه العملية خمس مرات. شطف الأغطية مرتين باستخدام 75٪ الإيثانول.
فصل بعناية ووضع الأغطية الفردية في رف معدني، مغطاة رقائق الألومنيوم، واحتضان في 50 درجة، لمدة 10 إلى 15 دقيقة، أو حتى تكون جافة تماما. تعقيم الأغطية في ضوء الأشعة فوق البنفسجية، لمدة 10 إلى 15 دقيقة. لطلاء الأغطية، وسوف تحتاج، وأغطية الزجاج العقيمة، لوحة 24-Well، ملاقط معقمة، 0.1 ملليغرام لكل مللي PDL الحل، الماء العقيم، 10 ميكروغرام في مللي حل لامينين، وسط عادي العصبية، وseciliary العقدية المتوسطة كاملة.
طلاء من الأغطية، وينبغي أن يتم في اليوم السابق للإجراء. باستخدام ملاقط معقمة، ضع غطاء واحد في كل بئر من لوحة 24-Well، أضف 500 ميكرولترات من محلول بولي dialyzing، بتركيز 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر، واحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة. في اليوم التالي، غسل الأغطية ثلاث مرات مع الماء المعقم، والتخلص من الماء، وإضافة 350 ميكرولتر من محلول اللامينيين بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى كل بئر.
مكان في حاضنة، في 37 درجة لمدة ساعتين. بعد هذا الوقت، وقبل طلاء الخلايا، وإزالة محلول اللامينيين، وغسل مرتين مع 300 ميكرولترات من وسط عصبي عادي. إضافة 300 ميكرولترات من المتوسط الكامل، ومكان في حاضنة، في 37 درجة و 5٪ CO2، حتى كنت على استعداد لصفيح الخلايا.
لإجراء تشريح، وسوف تحتاج، بيض الدجاج في يوم الجنين السابع، 75٪ الإيثانول، تشريح ملقط عدد 545 ورقم 55، مقص، ملعقة، تشريح أطباق بتري مع القاع الأسود والجليد الباردة HBSS الحل. تأكد من تعقيم جميع أدوات التشريح في 75٪ الإيثانول. يجب تخزين البيض عند درجة 16 قبل احتضانه في حاضنة للبويضات، عند 37.7 درجة، لمدة سبعة أيام، أو أي مرحلة جنينية أخرى مرغوبة.
في يوم الإجراء ، قم بإزالة البيض من الحاضنة ، رش البيض بنسبة 75٪ من الإيثانول. الحصول على الجزء العلوي من البيض باستخدام مقص، والخروج بعناية من embroy باستخدام ملعقة. وضع الجنين، في طبق بتري مع الجليد الباردة HBSS حل، وعلى الفور فصل الرأس من الجسم، عن طريق قطع في منطقة الرقبة.
ثم نقل الرأس إلى طبق بتري جديد مع الجليد النظيف حل HBSS الباردة. بمجرد إزالة الجنين من البويضة ، فإنه قادر على إنتاج البروتيات المسؤولة عن موت الخلايا. لذلك من المهم فصل الرأس عن الجسم في أسرع وقت ممكن، مرة واحدة في الجنين خارج البيضة لتقليل موت الخلايا.
من المهم جدا أيضا للحفاظ على رأس الجنين في الجليد الباردة HBSS حل. أمسكي رأس الجنين، وقم بإصلاحه في منقار الفرخ، ثم ابدأي في إزالة الطبقة الرقيقة من الجلد حول العين. بعناية، إزالة العين عن طريق تناوب بلطف بعيدا عن الرأس.
وبينما تفصل العين عن رأس الفرخ، لاحظ أن العصب البصري يتم تقسيمه. إبقاء العين مع الجانب الخلفي، وإشعار ganglion ciliary، المتاخمة للأعصاب البصرية الاستشعار والصدع choroid. وقد لا يزال العصب قبل الغلياني مرتبطاً بالعصاب الهدبي، مما يسهل تحديد هويته.
تشريح العقدة ciliary، من كل عين، وتنظيفه بشكل جيد جدا عن طريق إزالة الأنسجة الزائدة. نقل ganglia تشريح إلى طبق بتري مع حل HBSS على الجليد. من أجل الحصول على عائد من حوالي 1 مليون خلية لكل ملليلتر، يجب تشريح حوالي 70 ganglia، وأيضا نضع في اعتبارنا أن عدد الخلايا التي تم الحصول عليها، والخلايا غير الخلايا العصبية كذلك، وذلك من أجل تقليل عدد الخلايا غير العصبية، وأيضا لزيادة نقاء السكان الخاص اخصائية، من المهم لتنظيف ganglia ciliary بشكل جيد جدا ، إزالة جميع الأنسجة الزائدة.
لتفكك الأنسجة، وسوف تحتاج، لوحة 24-Well، 0.1٪ tripsin الحل، غير مكتملة ganglia الهزلي المتوسطة، وماصات البستر الزجاج المصقول النار، وماصة البسترة البلاستيكية. قبل الرطب الماصات البسترة البلاستيكية العقيمة، وجمع جميع ganglia ciliary إلى أنبوب 15 ML، والطرد المركزي لمدة دقيقتين في 200 Gs.Carefully، وإزالة جميع هابس المتوسطة، وذلك باستخدام ماصة البسترة لإزالة حجم أكبر، ومن ثم، عندما كنت أقرب إلى بيليه، واستخدام ماصة صغيرة. إضافة ملليلتر واحد من 0.1٪ tripsin الحل، واحتضان لمدة 20 دقيقة، في 37 درجة في حمام مائي.
الطرد المركزي لمدة دقيقتين، في 200 Gs.Immediately، وإزالة حل tripsin، وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة غير مكتملة. المصل في الوسط غير مكتملة، وسوف تتوقف فورا نشاط التربسين. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين، في 200 Gs، وإزالة كل المتوسطة.
إضافة 500 ميكرولترات من المتوسط الكامل، وبدء تفكك الأنسجة باستخدام p1000 ميكروبليت. تبدأ pipetting صعودا وهبوطا، 10 إلى 15 مرة، ومن ثم، والتحول إلى ماصة البسترة الزجاج المصقول النار، ومرة أخرى، ماص صعودا وهبوطا 10 إلى 15 مرة. يجب أن يصبح تعليق الخلية غير واضح ، كعلامة على تفكك الأنسجة الناجح.
حجم الضرورية لتفكك الخلايا يعتمد على عدد من ganglia ciliary التي تم الحصول عليها في هذا، وحجم بيليه. عندما pipetting صعودا وهبوطا لتفكك الأنسجة، فمن المهم تجنب تشكيل فقاعات الهواء، وهذا سوف يقلل من فقدان الخلايا. بعد خلايا إعادة الإنفاق، يمكنك ترك تعليق الخلية على الجليد حتى الطلاء.
تحديد الكثافة الخلوية باستخدام حل الأزرق trypan، في غرفة نيوباور. أن تعليق خلية الرصاص في المتوسط الكامل، مع 5FTU، في الكثافة المطلوبة ولوحة 500 ميكرولتر من الخلايا في بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تأكد من التحقق من ثقافتنا كل يوم ومتابعة تطور الخلايا. خلايا العقدة الإستيلاء تطوير سريع جدا في المختبر، وبعد يوم واحد، يمكننا أن نرى بالفعل بعض neurites تمتد من جسم الخلية. بعد سبعة إلى ثمانية أيام في المختبر ، وشبكة الخلايا العصبية راسخة للغاية ، ويمكن الحفاظ على الخلايا لمدة 15 يومًا على الأقل.
بعد يوم واحد في المختبر، تظهر الخلايا العصبية العقدية الهجبي الأساطير متعددة الأقطاب. ومع ذلك، تمديد نيوريت يحدث بسرعة في الخلايا العصبية التي أنشئت بشكل واضح شبكة الخلايا العصبية، بالفعل بعد 24 ساعة. في المختبر، الخلايا العصبية العقدية الهجبي هي المسؤولة عن اخصور العضلات في العين.
وهكذا، هذه الثقافات العصبية، هي مناسبة تماما لدراسة نقاط الاشتباك العصبي العضلي. لهذا, يمكن مطلي الخلايا العصبية العقدية ciliary على رأس خلايا العضلات. هنا، نعرض ثقافة ناجحة، من الخلايا العصبية العين الزجاجي، CG، على رأس الخلايا العصبية العضلات الفرخ V7 الفرخ.
علامة حويصلات متشابك, SV2, إظهار نقاط الاشتباك العصبي النشطة التي يتم تأسيسها بين المحاور العصبية CG, والألياف العضلية, التعرف بسهولة من قبل النوى المتعددة. الخلايا العصبية العقدية الإستيلية التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول هي مناسبة للكيمياء المناعية, electrophysiology, ومقالات البقاء على قيد الحياة من بين أمور أخرى. هذا البروتوكول تشريح, تسفر عن عدد منخفض جدا من الخلايا العصبية, ولكن إذا فعلت بشكل صحيح, سوف توفر السكان نقية من الخلايا العصبية cholinergic.
من المهم جدا أن يتم تنظيف كل ganglia بشكل جيد جدا وإزالة الأنسجة الزائدة. لذلك، يجب استخدام أدوات ذات جودة عالية، لذلك يمكن إزالة هذا النسيج من أجل منع التلوث من قبل الخلايا غير العصبية. سن الجنين سيحدد نجاح بروتوكولنا.
من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم تشريح بين E7 و E8. هذه النقطة الزمنية مهم جدا لأنه في هذه المرحلة، وفاة الخلايا التنموية التي تحدث عادة في المختبر لم يحدث حتى الآن. من أجل تقليل تلوث هذه الخلايا غير العصبية، ونحن نستخدم 5FTU في وسائل الإعلام الثقافة للحد من نمو الخلايا الدبقية والليفية. هذا النموذج الخلية يوفر بديلا ممتازا لدراسة مرض النيروموسكلار الخاص بك.
واستناداً إلى هذا البروتوكول، يمكن معالجة أسئلة علمية إضافية، على سبيل المثال، كيف أن توطين الخلايا الفرعية من كربونات محددة وبروبروتينات محددة ينظم تكوين المشبك الوظيفي ووظيفته. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من السهل إلى حد ما لإنشاء العصب الثقافات المشتركة للتعامل مع مزيد من الأسئلة مثل دراسة الأمراض العصبية العضلية.
