NZ רוצה להודות מעבדה חברי שובהאש ביזוואז, אנדרו Sproul, וראיין Willet לאימונים שלה לנתח והקציר נוירונים אוהד. נתמכות על ידי תרומות של NIH-NINDS.

1. הכנה לניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המנה המתאימה תרבות (10 ס&quot;מ או 6 צלחות, או גם 24 טוב, וכו &#39;) בהתאם לאופי הניסויים שלך, מעיל אותם עם זנב עכברוש 24 שעות לפני קולגן לנתיחה. שיטות להכנת עכברוש זנב קולגן ושימוש בו כדי המנות תרבות מעיל תוארו במקום אחר (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טריפסין 0.25% ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) (ללא EDTA) ולסנן לעקר. הכן 1 aliquots מ&quot;ל ולאחסן ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 2.5 מ&quot;מ כל אחד uridine ו-5-FDU ב מזוקקים / deionized H 2 O. מסנן לעקר ולהכין 50 aliquots μl. חנות ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני השלם: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 10% נסיוב סוס (חום להשבית ידי דוגרים על 56 º C waterbath במשך 30 דקות) ו -5% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סופי: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 1% סוס סרום + NGF (ריכוז 100ηg/ml הסופי) + פניצילין / סטרפטומיצין (1 / 250) + 1 / 250 פתרון uridine/5-FDU (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) . הערה: זה צריך להיות בינוני מורכב טרי לפני השימוש בכל פעם. לצורך ניסוי בתבנית של 24 גם צלחת, אחד יצטרך להכין 12 מ&quot;ל של מדיום זה. מומלץ לכם להכין תוספת קטנה. NGF ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים (ראו טבלה בסוף פרוטוקול זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: אחד יהיה צורך במיקרוסקופ הניתוח, מקור האור. מתכווננת כפול סיבים אופטיים עם הפנס טיפים התמקדות היא העדיפה. בנוסף, יהיה צורך לנקות לעקר (מעוקר או על ידי השריית באתנול 70% לפחות 20 דקות) כלי החיתוך הבא: שני זוגות של מיקרו לנתח מלקחיים נירוסטה, וזוג מספריים לנתח (גם נירוסטה ושניהם מ Roboz). שני מחטי מזרק סטרילי (26 gague x ½ 1 ס&quot;מ או דומה) יהיה גם צורך. יש צורך להגדיר לוח לנתיחה, המהווה 3 חתיכה &quot;x3&quot; של קלקר עטוף בנייר אלומיניום מכוסה Kimwipe. רסס את הלוח עם אתנול 70% כדי לטהר. לבסוף, להכין אש מלוטש פיפטה מרעה זכוכית. כדי אש פולנית, לקחת את פיפטה זכוכית והחזק את הטיפ הלהבה למשך כמה שניות, בעוד סיבוב. לאחר בדיקה, טיפ תיראה חלקה פתיחת יהיה צר יותר. זה הכרחי עבור השלב שבו התאים יהיה מנותק. בצע אש ליטוש ברדס תרבית תאים כך פיפטה נשאר סטרילי. </li></ol> 2. Dissection של הגרעינים צוואר הרחם מעולה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף גורים עכברוש בילוד כי הם בגיל P0 או P1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לנגב את הגור לנתיחה עם אתנול 70% כדי להפחית את הסיכויים לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף את הגור עם זוג מספריים חדות (שלב זה לא יהיה המוצג בסרטון). החזק את הראש באמצעות מלקחיים סטריליות נגד גזה סטרילית בקצרה לנקז דם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, ואת הקצה הזנב מכוונת כלפיך. קנה הנשימה הקטועה צריך להיות גלוי לעין. השתמש במחטים מזרק סטרילי כדי לאבטח את ראשו הכרות לרפד את הניתוחים באופן הבא: לדחוף אחד את הסיכה כי הגג של הפה לתוך כרית ולדחוף את מספר הזיהוי האישי השני כי קנה הנשימה החתוך לתוך כרית. הנח את כרית מתחת למיקרוסקופ לנתח ולהתחיל לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים (אחד בכל יד) העור לסלק שומן סביב קנה הנשימה, טיפול לא להיכנס עמוק מדי. פעולה זו תחשוף זוג שרירים פועל כמעט במקביל זה לזה משני צדי קנה הנשימה. הערה: במהלך דיסקציה, תצטרך להשקות עם PBS סטרילי קר או קר, סרום חינם בינוני 1640 RPMI נמסר עם סטרילית, פיפטה פסטר לשטוף דם עודף כדי לשמור על האזור נקי ולח. ניתן לעשות זאת רק פעם או יותר מפעם אחת, תלוי כמה מהר מהם עובד. עבור מבתר חוויה, זה לוקח רק כ 2-3 דקות לנתח את זוג הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים לחתוך ולהסיר את השרירים בצד אחד הראשונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שריר מוסר, העורק הראשי יהיה גלוי. לעתים קרובות הוא ורדרד בהיר והוא מכיל דם. זה אולי יראה בהיר יותר מאשר כלי דם אחרים אתה עשוי לראות בסביבה ומסיבה זו העורק הראשי לא יכול להיות מורגש מיד. עורק זה פועל לצד קנה הנשימה ואת bifurcates לתוך מה שנראה כמו &quot;Y&quot; בצורת סרט. הסתעפות זו היא ציון דרך חשוב ופעם הוא נמצא, זה יהיה קל יחסית למצוא את SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבר העורק בסוף הזנב ביותר להרים אותו מעט עם מלקחיים (את הקצה השני מחובר עדיין). ברגע שאתה עושה את זה, תוכל לראות שקדיות, מבריק מסה קטנה מחפש הרקמה מחוברת באופן רופף העורק רק בנקודת הסתעפות וכי יש thread דמוי מראש ו / או פוסט ganglionic connectives. זהו הגנגליון הצווארי מעולה. השתמש בזוג השני של מלקחיים ביד אחרים לנתק אותו בעדינות ומניחים בצלחת תרבות קטן (35 מ&quot;מ) המכיל קר, סרום חינם RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחלץ את הגנגליון בצד השני של קנה הנשימה בעקבות פרוטוקול זהה. </li></ol> 3. ניקוי הגרעינים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הגרעינים כבר גזור החוצה, הם צריכים להיות משוחרר ככל האפשר של רקמה זרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, אתה עשוי לראות כי בגרעיני יש המצורפת חתיכות של העורק הראשי, רקמת שומן או אחר. עבודה עם מלקחיים בכל יד לקנטר ממנו את החומרים האלה לא רצויות. המקום נוקה הגרעינים לתוך סטרילית 15ml חרוטי, צינור פוליפרופילן, המכיל RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Connectives מראש ו / או פוסט ganglionic צריך להיות גם מטופח משם. הגנגליון לכל אחד יש כ -10,000 נוירונים. לאחר הנוירונים מצופה, הם יוכלו לצמוח מחדש neurites שלהם. </li></ol> 4. ביסוס תרבות Neuron הסימפתטית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הגרעינים ב 200xg למשך 2 דקות ו למחוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגרעינים ב 0.5-1 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.25%. מקום 37 ˚ C waterbath או בחממה במשך 30 דקות. זה יעזור לנתק את התאים בגרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום השלם לדלל החוצה לנטרל את טריפסין ו צנטריפוגות ב 200xg במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend ב 2 מ&quot;ל של מדיום הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לנתק את התאים על ידי triturating הגרעינים למעלה ולמטה עם אש מלוטש פיפטה זכוכית למרעה. Triturate הגרעינים 20 פעמים במקום צינור על קרח למשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, אש לצחצח את פיפטה יותר לעשות פתיחת צר (כ 2 / 3 עד 1 / 2 מ&quot;מ קוטר). חכה כמה דקות עד שהוא מתקרר triturate הגרעינים פי 20 יותר. כפי שאתה ממשיך, המדיום יהפוך בהדרגה מעורפל המציין כי התאים נמצאים ניתק. חזור על פעולה זו פעם או פעמיים יותר תלוי גם לנתק את התאים. לאחר זמן מה, תוכלו להבחין כי כל הגרעינים יש ניתק לתוך הנוירונים ולא הגרעינים שלמים נראים בצינור. אולי יש קצת חומר הרקמה לא לנתק. בשלב זה, לתת הצינור לשבת קרח למשך כמה דקות, כך כל פסולת undissociated ניתן ליישב לתחתית. עכשיו בזהירות לאסוף כמעט את כל המדיום מלמעלה ומניחים צינור אחר. על מנת להבטיח כי אתה לא לאסוף את השברים undissociated, להשאיר כ 50 μl בחלק התחתון של הצינור. הוסף יותר של המדיום הסופי צינור המכיל תאים ניתק: בכרך זה תלוי בסוג של צלחת אחת היא באמצעות תרבות לתרבות נוירונים. לדוגמה: אם מנה של 24 גם הוא להיות מועסק, אז 0.5 צלחת הגרעינים היטב לכל (~ 10,000 נוירונים מדי טוב) ב 0.5 מ&quot;ל של מדיום הסופי לכל טוב. המלטה עכברוש טיפוסית מורכבת 12 גורים, אשר ייתן 24 הגרעינים. זה מספיק כדי צלחת אחת 24 גם הזרע ואת הנפח הכולל של המדיום הסופי הוא 12 מ&quot;ל. הערה: הגרעינים מכילים גם אוכלוסייה קטנה של גליה סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבות. Uridine/5-FDU שימוש במדיום הסופי שימנע את שגשוגם ולקדם את מותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזנת התאים כל 48 שעות על ידי החלפת 2 / 3 של המדיום עם טרי RPMI 1% סוס סרום + NGF ו uridine/5-FDU. הערה: בשלב ראשון, התרבות מכיל נוירונים אוהד שנראים עגול עם neurites לא. Neurites קצר להיות גלוי 24 שעות לאחר דיסקציה בהדרגה להיות צפופים מסועפת יותר לאורך זמן. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways.">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li><li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nerve+Growth+Factor:+purification+as+a+30,000-molecular-weight+protein.">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li><li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chat+in+the+Trophic+Web:+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling.">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li><li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development.">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+(NGF)+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons.">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li><li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents.">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).</li><li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways.">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו משתמשים חולדות Sprague Dawley עבור התרבויות שלנו. קח את הזמן והטיפול כאשר מנקים את הגרעינים. הסר את כל פסולת, כלי דם ושומן. שלב זה חשוב בהבטחת תרבות פחות או יותר הומוגני חינם של סוגי תאים זרים. תוספת של uridine/5-FDU יהיה בעיקר לחסל את התאים הלא העצבית (mitotic) הנותרי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps, Stainless steel #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4976</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640 w/ L-Glutamin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
<td>10-040-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>12103c</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donor Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>JRH Biosciences</td>
<td>12449</td>
<td>Heat-inactivate by incubating in 56&deg;C waterbath for 30 minutes.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco, Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin without EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Difco</td>
<td>MT 25-050-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>U3003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Fluoro-5' deoxyuridine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>F-8791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Harlan Bioproduct</td>
<td>BT-5025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Microscope and light source</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml polypropylene tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell culture dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning, Nunclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (scg)

הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) אצל חולדות הם קטנים, מבריק, דמוי שקד מבנים המכילים נוירונים אוהד. נוירונים אלה מספקים innervations אוהד לראש ואזורים הצוואר והם מהווים אוכלוסייה היטב מאופיין והומוגני יחסית (4). נוירונים הסימפתטית תלויים בגורם גדילה עצבי (NGF) לצמיחה, הישרדות בידול axonal והתפשטות רחבה הזמינות של NGF מקלה תרבותם מניפולציה ניסויית (2, 3, 6). מסיבות אלה, נוירונים בתרבית אוהד כבר בשימוש במגוון רחב של מחקרים כולל פיתוח בידול עצב, מנגנונים של מות תאים מתוכנת ופתולוגיים, ואת הולכת אותות (1, 2, 5, 6). לנתח את SCG מן החולדות יומו נוירונים culturing אוהד לא מאוד מסובך וניתן לשלוט די מהר. במאמר זה נתאר בפירוט כיצד לנתח את SCG מ גורים עכברוש היילוד להשתמש בהם כדי להקים תרבויות של נוירונים אוהד. המאמר כמו כן נתאר את הצעדים ההכנה ואת ריאגנטים שונים וציוד הנחוצים כדי להשיג זאת.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG at JoVE.com

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

22.7K Views.  Columbia University. זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

Video: Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

הכנה ותחזוקה של הגב הגרעינים נוירונים רוט בתרבויות מחולקים

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP binds to vasopressin V2 receptors (V2R) on the surface of the cells and thereby induces synthesis of cAMP. This stimulates cellular signaling processes leading to changes in the phosphorylation of the water channel aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 and thereby triggers the translocation of AQP2 from intracellular vesicles into the plasma membrane facilitating water reabsorption from primary urine. Aberrations of AVP release from the pituitary or AVP-activated signaling in principal cells can cause central or nephrogenic diabetes insipidus, respectively; an elevated blood plasma AVP level is associated with cardiovascular diseases such as chronic heart failure and the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion.
Here, we present a protocol for cultivation of primary rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells, which express V2R and AQP2 endogenously. The cells are suitable for elucidating molecular mechanisms underlying the control of AQP2 and thus to discover novel drug targets for the treatment of diseases associated with dysregulation of AVP-mediated water reabsorption. IMCD cells are obtained from rat renal inner medullae and are used for experiments six to eight days after seeding. IMCD cells can be cultured in regular cell culture dishes, flasks and micro-titer plates of different formats, the procedure only requires a few hours, and is appropriate for standard cell culture laboratories.

Arginine-vasopressin (AVP) controls fine-tuning of body water homeostasis through facilitating water reabsorption by renal principal cells. Here, we present a protocol for the cultivation of primary rat inner medullary collecting duct cells suitable for the elucidation of molecular mechanisms underlying AVP-mediated water reabsorption.

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle biopsies are often collected for these endeavors. However, relatively few technical descriptions of biopsy procedures, outside of the commonly used musculus vastus lateralis, are available. Although the biopsy techniques are often adjusted to accommodate the characteristics of each muscle under study, few technical reports share these changes to the greater community. Thus, muscle tissue from human participants is often wasted as the operator reinvents the wheel. Expanding the available material on biopsies from a variety of muscles can reduce the incident of failed biopsies. This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique on the musculus tibialis anterior that limits fiber damage and provides fiber lengths adequate for mechanical evaluation. The surgery is an outpatient procedure that can be completed in an hour. The recovery period for this procedure is immediate for light activity (i.e., walking), up to three days for the resumption of normal physical activity, and about one week for wound care. The extracted tissue can be used for mechanical force experiments and here we present representative activation data. This protocol is appropriate for most collection purposes, potentially adaptable to other skeletal muscles, and may be improved by modifications to the collection needle.

This technical report describes a variation of the modified Bergstr&#246;m technique for the biopsy of the musculus tibialis anterior that limits fiber damage.

אוסף של ביופסיות שריר השלד מהתאי העליון של השרירים האנושיים Tibialis הקדמי להערכה מכנית

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...