tRNA 的独特特征之一是修饰碱基的存在。在一些 tRNA 中，修饰的碱基占分子中总碱基的近 20%。总而言之，这些不寻常的碱基可以保护 tRNA 免受 RNase 的酶促降解。

这些化学修饰中的每一种都由一种特定的酶携带，即转录后。所有这些酶都具有独特的碱基特异性和位点特异性。甲基化是最常见的化学修饰，由至少 9 种不同的酶携带，其中 3 种酶专门用于不同位置的鸟嘌呤甲基化。

这些修饰碱基的性质和位置是物种特异性的。因此，有几个碱基是真核生物或原核生物独有的。例如，腺嘌呤的巯基化仅在原核生物中观察到，而胞嘧啶的甲基化仅限于真核生物。总体而言，真核 tRNA 的修饰程度大于原核生物的 tRNA。

尽管修饰的性质可能有所不同，但 tRNA 的某些区域总是被严重修饰。tRNA 的三个茎环区域或"臂"中的每一个都有用于独特目的的修饰碱基。TΨC 臂以核苷酸、胸腺嘧啶、假尿嘧啶和胞嘧啶的存在命名，在翻译过程中被核糖体识别。包含修饰的嘧啶二氢尿嘧啶的 DHU 或 D 臂作为氨酰基-tRNA 合成酶的识别位点，该酶催化氨基酸与 tRNA 的共价加成。反密码子环通常有一个 queuine 碱基，这是一种修饰的鸟嘌呤。这个碱基与 mRNA 上的密码子序列产生一个 Wobble 对，即它形成一个不遵循 Watson-Crick 碱基对规则的碱基对。通常，tRNA 在密码子的第三个位置更"松散地"结合 mRNA。这允许在第三个密码子位置出现几种类型的非 Watson-Crick 碱基配对或 Wobble 碱基。据观察，反密码子的第一个位置存在 queuine，它与密码子的第三个位置配对，提高了 tRNA 的翻译准确性。