Одной из уникальных особенностей тРНК является присутствие модифицированных оснований. В некоторых тРНК модифицированные основания составляют почти 20% от общего количества оснований в молекуле. В совокупности эти необычные основания защищают тРНК от ферментативной деградации РНКазами.

Каждая из этих химических модификаций осуществляется определенным ферментом после транскрипции. Все эти ферменты обладают уникальной специфичностью к основаниям и сайтам. Метилирование, наиболее распространенная химическая модификация, осуществляется по крайней мере девятью различными ферментами, причем три фермента предназначены для метилирования гуанина в разных положениях.

Природа и положение этих модифицированных оснований зависят от вида. Таким образом, существует несколько оснований, эксклюзивных для эукариот или прокариот. Например, тиолирование аденина наблюдается только у прокариот, тогда как метилирование цитозина ограничивается эукариотами. В целом тРНК эукариот модифицируются в большей степени, чем тРНК прокариот.

Хотя характер модификаций может различаться, некоторые участки тРНК всегда сильно модифицированы. Каждая из трех областей стебель-петля или “плечей'' тРНК имеют модифицированные основания, которые служат уникальным целям. Плечо TΨC, названное в честь присутствия нуклеотидов тимина, псевдоуридина и цитозина, распознается рибосомой во время трансляции. Плечо ДГУ, или D, содержащее модифицированный пиримидин дигидроурацил, служит сайтом узнавания для фермента аминоацил-тРНК синтетазы, который катализирует ковалентное присоединение аминокислоты к тРНК. Петля антикодона часто имеет основание кьюин, которое представляет собой модифицированный гуанин. Это основание создает неоднозначную пару с последовательностью кодона на мРНК, то есть образует пару оснований, которая не соответствует правилам спаривания оснований Уотсона-Крика. Обычно тРНК связывает мРНК более “слабо” в третьей позиции кодона. Это позволяет использовать несколько типов пар оснований, отличных от Уотсона–Крика, или неоднозначное спаривание оснований, в положении третьего кодона. Было замечено, что присутствие кьюина в первой позиции антикодона, которая спаривается с третьей позицией кодона, улучшает трансляционную точность тРНК.