Jedną z unikalnych cech tRNA jest obecność zmodyfikowanych zasad. W niektórych tRNA zmodyfikowane zasady stanowią prawie 20% wszystkich zasad w cząsteczce. W sumie te niezwykłe zasady chronią tRNA przed enzymatyczną degradacją przez RNazy.

Każda z tych modyfikacji chemicznych jest przenoszona przez określony enzym, po transkrypcji. Wszystkie te enzymy mają unikalną specyficzność zasadową i miejscową. Metylacja, najczęstsza modyfikacja chemiczna, jest przenoszona przez co najmniej dziewięć różnych enzymów, z których trzy są przeznaczone do metylacji guaniny w różnych pozycjach.

Charakter i położenie tych zmodyfikowanych zasad są specyficzne dla gatunku. Tak więc istnieje kilka zasad, które są dostępne wyłącznie dla eukariontów lub prokariontów. Na przykład tiolowanie adeniny obserwuje się tylko u prokariontów, podczas gdy metylacja cytozyny jest ograniczona do eukariontów. Ogólnie rzecz biorąc, eukariotyczne tRNA są modyfikowane w większym stopniu niż te pochodzące od prokariontów.

Chociaż charakter modyfikacji może się różnić, niektóre regiony tRNA są zawsze silnie zmodyfikowane. Każdy z trzech regionów pętli macierzystej lub "ramion" tRNA ma zmodyfikowane zasady, które służą unikalnym celom. Ramię TΨC, nazwane tak na cześć obecności nukleotydów, tyminy, pseudourydyny i cytozyny, jest rozpoznawane przez rybosom podczas translacji. Ramię DHU lub D, które zawiera zmodyfikowany dihydrouracyl pirymidynowy, służy jako miejsce rozpoznawania enzymu syntetazy aminoacylo-tRNA, który katalizuje kowalencyjne dodawanie aminokwasu do tRNA. Pętla antykodonu często ma zasadę queuinową, która jest zmodyfikowaną guaniną. Ta zasada tworzy parę Wobble'a z sekwencją kodonów na mRNA, tj. tworzy parę zasad, która nie jest zgodna z regułami par zasad Watsona-Cricka. Zwykle tRNA wiąże mRNA bardziej "luźno" w trzeciej pozycji kodonu. Pozwala to na kilka typów parowania zasad innych niż Watson-Crick lub zasad Wobble w trzeciej pozycji kodonu. Zaobserwowano, że obecność queuiny w pierwszej pozycji antykodonu, która łączy się z trzecią pozycją kodonu, poprawia dokładność translacji tRNA.