标准化的制备小鼠肺组织单细胞悬浮液使用gentleMACS Dissociator

摘要

游离特定的组织类型的细胞，组织鼓动的具体参数，以获得一个可行的，可培养细胞的高容量。美天旎gentleMACS dissociator优化这个任务简单，实用的协议。在本出版物中使用本仪器对肺组织进行了解释。

摘要

从组织单细胞悬液的制备细胞研究中的许多实验的重要前提。游离整个器官的过程中，需要在特定的参数，在重现的方式获取大量的活菌。 gentleMACS Dissociator优化这个任务简单，实用的协议。该仪器包含预编程的优化设置的多种组织类型，包括小鼠肺的效率，但温和的分解。在本出版物中使用从小鼠的肺组织gentleMACS Dissociator证明。

研究方案

若要在无菌条件下，它是建议执行层流罩中的所有步骤。

1。材料

1. HEPES缓冲液：10毫米HEPES - NaOH溶液pH值7.4，150 mM氯化钠，氯化钾5毫米，1毫米MgCl _2的 ，1.8毫米氯化钙_2）
2. 胶原酶D解决方案：胶原酶D：100毫克/毫升（胶原酶ð> 0.15 U /毫克），在HEPES缓冲
3. DNA酶我的解决方案：2万U / mL的DNA酶我
4. 在pH 7.2的PBS缓冲液
5. PEB的缓冲区：BSA在20部分第1部分股票解决方案autoMACS冲洗液
6. 组织：从6 / 7周龄成年雌性BALB / C鼠，毗邻器官的肺。
7. 可选：表面CD11c微珠，MACS MS色谱柱，磁珠隔离从小鼠肺癌的单细胞悬液的树突状细胞的分离器

2。游离的肺组织

1. 一个Petri菜含有PBS去除红细胞冲洗组织。
2. 最大为450 mg肺组织转移到一个gentleMACS C管含有4.9 mL的HEPES缓冲。
3. 加入100μL的胶原酶D溶液的终浓度为2 mg / mL胶原酶D.
4. 加入10μL的DNA酶高达150毫克的组织（终浓度为40 U / ml的DNA酶我）或20μL的DNA酶我为150-450毫克肺组织（终浓度为80 U / mL的DNA酶我）我的解决方案。
5. 紧紧贴着C管和附加到gentleMACS Dissociator它。然后运行该程序“m_lung_01”。
6. 孵育30分钟，在37 ° C，自动旋转或手动转动，每5分钟。
7. 返回样本gentleMACS Dissociator和运行方案“m_lung_02”。

3。过滤

1. 准备取代第70微米网状细胞过滤器收集筛选细胞50毫升管。
2. 第二gentleMACS计划一旦结束，根据分布在管内的样品材料，您可能离心管简单地收集在试管底部的样品材料。
3. 通过隔膜密封的C管，使用第一个合适的1000μL枪头取出细胞，并将其应用到细胞过滤器。
4. 5毫升HEPES缓冲液在室温下的细胞滤网清洗。
5. 一个颗粒细胞在300xg离心10分钟，在50毫升管。
6. 吸上清，重悬细胞沉淀在你想要的PEB的缓冲量。

第4部分：代表性的成果：

图1。龙gentleMACS™Dissociator分解导致92％的活细胞。死细胞荧光染色，碘化丙啶（PI）（右点图，左点图：没有PI染色）。

图2。使用gentleMACS Dissociator结果在一个可行的白细胞和内皮细胞的高比例对小鼠肺组织分离。派生的单细胞悬液与CD45 - PE，CD146 - FITC或CD31 - FITC染色和流式细胞仪分析。

表面CD11c - FITC和反mPDCA - 1 - APC检测鼠标的CD11c ^低 M - PDCA - 1 +浆区议会，以及表面CD11c ^高细胞染色图3。小鼠肺组织所得的单细胞悬液。

图4。使用树突状细胞表面CD11c微珠，MiniMACS分离器和两个MS色谱柱的富集。

讨论

在这个视频中，我们引入一个新的小鼠肺组织的分离方法。我们展示的机械和酶治疗肺组织结合，取得了一个可行的白细胞和内皮细胞的高比例。具体来说，组织机械解体取得gentleMACS Dissociator。 gentleMACS彗星管包括一个转子 - 定子系统，它游离在一种温和的方式组织。过程控制仪器的程序设置。这些设置进行了优化，实现高产和细胞活力。派生的单细胞悬液与CD45 - PE，CD146 - FITC或CD31 - FITC染色和?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C Tubes	Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator	Miltenyi Biotec	Order no. 130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads	Miltenyi Biotec	Order No. 130-052-001	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE	Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-026130-091-830	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC	Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-963	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC	Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-026	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE	Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-610	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips	Molecular BioProducts	Order no. 2079	http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61 http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html