Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.

Аннотация

Подготовка одноклеточных суспензий из тканей является важной предпосылкой для многих экспериментов в сотовых исследований. Процесс диссоциации целые органы требует специфических параметров, чтобы получить большое количество жизнеспособных клеток в воспроизводимым образом. GentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. Инструмент содержит предварительно запрограммированными настройками, которые оптимизированы для эффективной, но нежный диссоциации различных типов тканей, в том числе мыши легких. В этой публикации использование диссоциатор gentleMACS на легочную ткань производным от мышей показано.

протокол

Для работы в стерильных условиях, то рекомендуется выполнять все шаги в ламинарном боксе.

1. Материалы

  1. HEPES буфера: 10 мМ HEPES-NaOH рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2)
  2. Коллагеназа D решение: Коллагеназа D: 100 мг / мл (коллагеназы D> 0,15 ЕД / мг), в HEPES буфере
  3. Я ДНКазы решение: 20000 Ед / мл ДНКазы I
  4. PBS буфере при рН 7,2
  5. PEB буфера: 1 часть маточного раствора BSA в 20 частях autoMACS Промывка решения
  6. Ткани: легкие производным от 6 / 7 недель старой взрослой самки BALB / C мышей, свободных от прилегающих органов.
  7. Дополнительно: CD11c микрошарики, MACS MS Столбцы MACS сепаратор для выделения дендритных клеток из мышиных легких одной клеточной суспензии

2. Диссоциирующего легочной ткани

  1. Промойте ткань в чашке Петри содержащие PBS для удаления эритроцитов.
  2. Передача максимум 450 мг ткани легкого для труб gentleMACS С, содержащего 4,9 мл HEPES буфера.
  3. Добавить 100 мкл Коллагеназа D решение конечной концентрации 2 мг / мл коллагеназы D.
  4. Добавьте 10 мкл ДНКазы я решение для до 150 мг ткани (конечная концентрация 40 ед / мл ДНКазы I) или 20 мкл ДНКазы я за 150-450 легочной ткани мг (конечная концентрация 80 ЕД / мл ДНКазы I).
  5. Плотно закрыть трубы С и прикрепить его на диссоциатор gentleMACS. Затем запустите программу "m_lung_01".
  6. Инкубируйте в течение 30 мин при 37 ° C с автоматическим вращением или вручную поворотом каждые 5 мин.
  7. Вернуться образца диссоциатор gentleMACS и запустить программу "m_lung_02".

3. Фильтрация

  1. Подготовка 50 мл трубки для сбора отфильтрованных ячеек, заменив шапка с 70 мкм сито ячейки сетки.
  2. После второй программе gentleMACS концов, в зависимости от распределения материала образца в трубке, вы можете центрифуге трубки кратко собрать образцы материала в нижней части трубы.
  3. Удалить клеток через перегородку запечатанном крышкой трубки С помощью подходящего 1000 мкл кончика пипетки и применять их в ячейки фильтра.
  4. Вымойте ячейки фильтра с 5 мл HEPES буфера при комнатной температуре.
  5. Центрифуга клетки осадок в 50 мл трубки на 300xg течение 10 мин.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в желаемом объеме буфера PEB.

Часть 4: Представитель Результаты:

figure-protocol-2553
Рисунок 1. Легкого диссоциации с gentleMACS ™ диссоциатор привело к 92% жизнеспособных клеток. Мертвые клетки флуоресцентно окрашенных пропидий йодида (PI) (право сюжет точку; левый участок точка: нет окрашивания PI).

figure-protocol-2888
Рисунок 2. Диссоциация мыши легочной ткани с использованием результатов gentleMACS диссоциатор в высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Производных одноклеточных суспензий окрашивали CD45-PE и CD146-FITC или CD31-FITC и анализировали с помощью проточной цитометрии.

figure-protocol-3299
Рисунок 3. Single-клеточной суспензии производным от мыши легочной ткани окрашивали CD11c-FITC и Анти-mPDCA-1-APC для обнаружения мыши CD11c низкий м-PDCA-1 + plasmacytoid контроллеров домена, а также высокой CD11c клеток.


figure-protocol-3668
Рисунок 4. Обогащение дендритных клеток с использованием CD11c микрошарики, сепаратор MiniMACS и два MS Столбцы.

Обсуждение

В этом видео, мы вводим новый метод диссоциации легочной ткани мыши. Мы показали, что сочетание механических и ферментативных лечения легочной ткани дали высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток. В частности, механические распада тканей было достигнуто за сч?...

Раскрытие информации

The authors are employees of Miltenyi Biotec GmbH who make the instrument used in this article.

Благодарности

Авторы являются сотрудниками Miltenyi Biotec GmbH, Германия.

Материалы

Material NameTypeCompanyCatalogue NumberComment
NameCompanyCatalog NumberComments
C Tubes Miltenyi BiotecOrder no. 130-093-237http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi BiotecOrder no. 130-093-235http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi BiotecOrder no. 130-090-753http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi BiotecOrder no. 130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi BiotecOrder no. 130-091-376http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads Miltenyi BiotecOrder No. 130-052-001http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE Miltenyi BiotecOrder no. 130-092-026 130-091-830http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC Miltenyi BiotecOrder no. 130-091-963http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC Miltenyi BiotecOrder no. 130-092-026http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE Miltenyi BiotecOrder no. 130-091-610http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi BiotecOrder no. 130-093-233http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProductsOrder no. 2079http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

29

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены