הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

Summary

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.

Abstract

הכנת תא בודד השעיות מרקמות היא תנאי חשוב ניסויים רבים במחקר הסלולר. תהליך dissociating איברים שלם דורש פרמטרים ספציפיים על מנת לקבל מספר גבוה של תאים חיים בצורה לשחזור. Dissociator gentleMACS מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. המכשיר מכיל מתוכנתים מראש הגדרות מותאמות דיסוציאציה היעילה אך עדין של מגוון רחב של סוגי רקמות, כולל הריאות העכבר. בפרסום זה השימוש Dissociator gentleMACS על רקמת הריאה נגזר עכברים מודגם.

Protocol

כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית.

1. חומרים

1. HEPES חיץ: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl _2, 1.8 mM CaCl ₂₎
2. Collagenase פתרון D: collagenase D: 100 מ"ג / מ"ל ​​(collagenase D> 0.15 U / מ"ג), ב HEPES חיץ
3. DNase פתרון אני: 20,000 U / mL DNase אני
4. PBS חוצץ ב-pH 7.2
5. PEB חיץ: 1 חלק BSA במלאי פתרון ב 20 חלקים autoMACS פתרון שטיפה
6. רקמות: ריאות הנגזרות 6 / 7 שבוע הישן נקבה בוגרת BALB / C העכבר, ללא איברים סמוכים.
7. אופציונלי: microbeads CD11c, MACS עמודות MS, MACS מפריד עבור בידוד של תאים דנדריטים מן ההשעיה ריאות תא בודד העכבר

2. Dissociating רקמת הריאה

1. יש לשטוף את רקמת בצלחת פטרי המכילות PBS להסיר אריתרוציטים.
2. העברה מרבי של רקמת הריאה עד 450 מ"ג Tube gentleMACS C המכיל 4.9 מ"ל HEPES חיץ.
3. הוספת 100 μL פתרון D collagenase לריכוז סופי של 2 מ"ג / מ"ל ​​collagenase ד
4. הוסף 10 פתרון μL DNase אני בעד רקמה 150 מ"ג (הריכוז הסופי של 40 U / ml DNase אני) או 20 μL DNase אני עבור רקמת הריאה 150-450 מ"ג (הריכוז הסופי של 80 U / mL DNase אני).
5. חזק לסגור את Tube C וצרף אותו על Dissociator gentleMACS. ואז להפעיל את התוכנית "m_lung_01".
6. דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות עם סיבוב אוטומטי או ידני להפוך כל 5 דקות.
7. חזור מדגם Dissociator gentleMACS ולהפעיל את התוכנית "m_lung_02".

3. סינון

1. הכן צינורית 50 מ"ל לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת מכסה עם מסננת רשת 70 מיקרומטר התא.
2. לאחר תוכנית second gentleMACS מסתיים, בהתאם לחלוקת חומר מדגם בצינור, ייתכן צנטריפוגות הצינור קצר כדי לאסוף את החומר מדגם בחלק התחתון של הצינור.
3. הסר את התאים באמצעות כובע חתום של מחצה התחתית C באמצעות קצה מתאים 1000 פיפטה μl ולהחיל אותן על מסננת את התא.
4. שטפו את מסננת תא עם חיץ HEPES 5 מ"ל ב RT.
5. צנטריפוגה את התאים גלולה בצינור 50 מ"ל ב 300xg במשך 10 דקות.
6. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה בהיקף הרצוי מאגר PEB.

חלק 4: תוצאות נציג:

באיור 1. הביאה ריאות דיסוציאציה עם ™ gentleMACS Dissociator בתאים קיימא 92%. תאים מתים היו מוכתמים fluorescently עם יודיד propidium (PI) (העלילה נקודה הנכונה; העלילה נקודה שמאל: לא מכתים PI).

איור 2. דיסוציאציה של רקמת הריאה באמצעות העכבר את התוצאות Dissociator gentleMACS באחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. נגזר תא בודד השעיות הוכתמו CD45-PE ו-CD146 FITC או CD31-FITC ונותחו על ידי cytometry הזרימה.

איור 3. תא בודד ההשעיה נבעה רקמת הריאה העכבר היה מוכתם CD11c-FITC ואנטי mPDCA-1-APC לאתר עכבר CD11c ^נמוך מ-PDCA-1 + DCs plasmacytoid כמו גם תאים ^גבוה CD11c.

איור 4. והעשרה של תאים דנדריטיים באמצעות microbeads CD11c, מפריד MiniMACS ושני טורים MS.

Discussion

בסרטון הזה, אנו מציגים שיטה חדשה דיסוציאציה של רקמת הריאה העכבר. אנו מראים כי שילוב של טיפול מכני האנזימטית של רקמת הריאה הניבו אחוז גבוה של לויקוציטים לתאי אנדותל קיימא. באופן ספציפי, התפוררות מכנית של רקמת הושגה על ידי Dissociator gentleMACS. C צינורות gentleMACS כוללים הרוטור - מער...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
C Tubes		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
gentleMACS™ Starting Kit		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator		Miltenyi Biotec	Order no. 130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution		Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution		Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
CD11c MicroBeads		Miltenyi Biotec	Order No. 130-052-001	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx
CD11c-FITC, CD11c-PE		Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-026 130-091-830	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx
Anti-mPDCA-1-APC		Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-963	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx
CD146-FITC		Miltenyi Biotec	Order no. 130-092-026	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx
CD45-PE		Miltenyi Biotec	Order no. 130-091-610	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx
Propidium Iodide Solution		Miltenyi Biotec	Order no. 130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips		Molecular BioProducts	Order no. 2079	http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61 http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html