含量为病原体相关分子模式（PAMP）触发免疫功能的植物（公共交通交汇处）

摘要

一个细胞死亡为基础的公共交通交汇处的检测在烟草benthamiana植物描述。

摘要

察觉到他们的环境中潜在的病原体，植物使用其细胞膜上的模式识别受体（PRRS）。 PRRS承认保守的微生物称为病原体相关分子模式（PAMPS）的功能，这种检测PAMP触发的免疫力（PTI），从而有效地防止非^致病菌 1,2的定植植物组织。在公共交通交汇处的最深入研究的系统是FLS2 ^依赖途径3。 FLS2识别PAMP flg22是细菌鞭毛蛋白的一个组成部分。

成功的病原体具有致病因素或效应，可以抑制公共运输交汇处和允许的病原体引起的^疾病 1 。反过来，有些植物具有耐药基因检测的效应或他们的活动，从而导致效应触发免疫^{“（ETI）2} 。

我们描述了一个公共交通交汇处的细胞死亡为基础的检测OH和^Collmer 4修改。该实验是在 N标准化benthamiana，正在越来越多地用来作为一个模型系统研究植物^病原体的相互作用5。 PTI是诱导渗透到叶的非致病细菌菌株。七个小时后，一个细菌菌株引起的疾病或激活ETI是渗透到原来的渗透区重叠地区。第一浸润引起PTI是能够延缓或阻止细胞死亡的第二个挑战浸润的外观。相反，在接种重叠区的出现表明细胞死亡的一个公共交通交汇处的击穿。

4个公共交通交汇处和挑战接种诱导的不同组合进行了规范（见表1）。检测测试对非沉默北路benthamiana植物，作为控制和FLS2沉默的植物进行了预测，在他们的能力，发展公共交通交汇处受到损害。

研究方案

第1部分：植物的生长和维护

烟草benthamiana在试验中使用的植物应约7周之久。他们应修剪前至少有4-5天检测，以除去所有腋的分支机构和花卉。这是一个好主意，去除腋窝分行后，很快便出现在为了使植物更便于管理。

第2部分：细菌培养

第一天：

1. 在检测中使用的所有株板或文化都在同一时间启动。对于假单胞菌 。其中包括2诱导和3株挑战到KBM板，条纹细菌含冷冻甘油股票（见表2）适当的抗生素。板中心应少量的细菌传播。约18-24小时，在30 ° C孵育板。 农杆菌介导 ，启动于2 mL LB液体文化，从一个全新的板块和成长在250转过夜，30 ° C 。

第2天：

2. 对绿脓杆菌 ，加入150-200μl液体KBM的细菌，它们遍布整个板使用无菌玻璃吊具。板背面在孵化器，并让它为20-24小时，增长。应该有一个细菌草坪上板，第二天，显示良好的增长势头。 农杆菌介导 ，启动约20微米的乙酰丁香酮5-10毫升LB次要的文化，让它过夜，以20小时增长250 RPM，30 ° C 。

第3部分：准备检测植物

第2天：

1. 检测前一天的植​​物应该被移到一个房间在22-24℃，约35-40％RH和恒定的光。
2. 马克叶片上，至少有直径1.5厘米，用厚厚的黑色标记的圆圈。可以标明每叶二至四个圆圈。界应该得到很好的间距，最好不要跨大静脉。选择良好的扩展叶。避免坚韧或较厚的触摸和避免标志着各界对叶下部老叶或树叶。

标记各界实验前一天是没有必要的协议。然而，节省了时间，如果被检测的植物有大量，使得它更容易实现之间的公共交通交汇处的感应和挑战接种的精确定时。

第4部分：电磁炉的公共交通交汇处

第3天：

1. 收获从板的细胞在10毫米MgCl _2的 荧光为 P 和 P 恶臭假单胞菌 。 农杆菌介导 ，离心机的文化，收集细胞，悬浮10MM _氯化镁 2 + 10毫米MES的pH值5.6 。重复离心和悬浮在MgCl _2的 MES解决方案。测量细胞在600 nm的光密度（OD）。消耗臭氧层物质调整到最后的表2中所述的氯化镁假单胞菌应终于在10毫米悬浮氯化镁₂和农杆菌 ₂ - MES解决方案所需的值。一个25毫升的总量是足够的接种约40-50点。
2. 渗入叶使用1毫升的无针注射器的标界的交汇处诱导。写下在植物渗透的秩序和渗透开始时的确切时间。

第5部分：挑战接种

1. 准备P。丁香 PV。 番茄 DC3000，DC3000 的PstΔhopQ1 - 1和PS PV。 粉虱的部分4.1和表2中所述的挑战。
2. 七小时后，诱导渗透，执行相同的顺序在植物的挑战渗透，作为诱导。一般来说，第一次接种圈的边缘上的点可以用来作为第二次接种圈的中心。如果有一片叶子上的多点，然后确保不重叠渗透。
3. KBM或含有适当抗生素的LB板的检测，以确定确切的CFU数量的所有文化板块连续稀释。

第6部分：交汇处分项评分

第5天：

1. 看看，由于到ETI细胞死亡的外观，在用Pst DC3000挑战点。渗透重叠区域内的细胞死亡表示交汇处击穿，应被视为一个积极的表型中取得的。

第7天：

2. 寻找点用 Pst DC3000ΔhopQ1 - 1或 PS光伏挑战由于疾病的细胞死亡的外观。粉虱。分数如6.1部分所述的表型为以同样的方式积极。

当控制植物（不应该损害交汇处）开始出现在重叠区域的渗透细胞死亡，停止任何进一步的意见。

第7部分：代表结果

图1显示的检测结果时， 体育被用作荧光诱导和面临的挑战PST DC3000。

图1。 体育荧光是渗透到N 。 benthamiana叶（黑圈），以促使公共交通交汇处和7个小时后，当场被用 Pst DC3000（白色圆圈）的挑战。 FLS2沉默植株所在地区体育的公共交通交汇处击穿荧光是渗透（一），细胞死亡。不沉默的控制，植物没有显示在重叠区，由于公共运输交汇处（二）诱​​导细胞死亡。红色箭头表示缺乏或细胞死亡存在重叠区域的渗透。照片是2天之后的渗透。请点击这里看到图1的放大版本。

公共交通交汇处诱导	细胞死亡，从而引发的挑战	细胞死亡的性质	守则
荧光假单胞菌 55	假单胞菌丁香光伏番茄（PST）。DC3000 6	ETI	PF / DC
P.恶臭假单胞菌 KT2440	PST DC3000	ETI	PP / DC
P.荧光 55	PST DC3000ΔhopQ1 - 1 6	疾病	Pf/Q1-1
农杆菌 GV2260	P.丁香 PV。粉虱11528R	疾病	农业/ PTAB

表1：公共交通交汇处的诱导和细胞死亡引出的公共交通交汇处的细胞死亡的实验中使用的微生物组合。

菌株	选择培养基	最后外径在实验中使用	相应的CFU /毫升
P.荧光 55	KBM氨苄青霉素（100微克/毫升）	0.5	1 × 10 9
P.恶臭假单胞菌 KT2440	KBM氨苄青霉素（100微克/毫升）	0.5	1 × 10 8
A.农杆菌 GV2260	LB利福平（100微克/毫升）	0.5	5 × 10 8
PST DC3000	KBM利福平（100微克/毫升）	0.02	2 × 10 7
PST DC3000ΔhopQ1 - 1	KBM利福平（100微克/毫升）	100倍稀释液0.1	1 × 10 6
P.丁香 PV。粉虱11528R	KBM利福平（100微克/毫升）	100倍稀释液0.1	1 × 10 6

表2：文化条件，并在实验中使用的接种水平。分光光度计之间的不同品牌的OD和相应的CFU水平可能会有所不同。

讨论

可用于细胞死亡为基础的检测，以确定参与基因在公共交通交汇处。例如，一个感兴趣的基因丧失功能的突变体，可以使用这个实验测试。诱导和表1中给出的挑战接种的4种组合，这是可能的，只有一个组合可能会导致在您的工厂背景的表型。我们观察到植物FLS2沉默PF / DC和Pf/Q1-1诱导和挑战接种（见表1）组合在一个公共交通交汇处击穿。

它是必不可少的，检测的环境条件尽可能接近3.1部分所述。湿度低，导致细胞死亡进行太快，使检测难以得分。我们的协议中所描述的条件，如果不工作在自己的实验室，然后尝试改变诱导或挑战接种水平。另一个参数是可以修改的诱导和挑战之间的时间差距，虽然我们已经发现，较短的时间差距造成的检测，以打破在控制植物太快。

我们建议，至少4-5植物在实验测试和积极的表型应至少在3-4个独立实验重复。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730