Анализ для Возбудитель-Associated молекулярной Pattern (PAMP)-Triggered Иммунитет (PTI) в растениях

Резюме

Гибель клеток основе анализа для ПТИ в Nicotiana растений benthamiana описано.

Аннотация

Воспринимать потенциально патогенных микроорганизмов в окружающей их средой, растения используют распознавания образов рецепторы (РРСС), присутствующих на их мембранах плазмы. PRRS признать сохраняется микробной функции называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPs), и это приводит к обнаружению PAMP-срабатывает иммунитет (ПТИ), который эффективно предотвращает колонизацию тканей растений, не являющихся возбудителями ^1,2. Наиболее хорошо изучена система в ПТИ является FLS2-зависимого пути ^3. FLS2 признает PAMP flg22, являющийся компонентом бактериальной флагеллин.

Успешное возбудителей обладают факторы вирулентности или эффекторами, которые могут подавлять PTI и позволяют возбудителя вызывают заболевания ^1. Некоторые растения, в свою очередь обладают гены устойчивости, которые обнаруживают эффекторов или их деятельность, что приводит к эффектор-срабатывает иммунитет (ETI) ^2.

Мы описываем гибели клеток основе анализа для PTI редактировался Ох, и Collmer ^4. Анализ был стандартизован в Н. benthamiana, которые все более широко используется в качестве модельной системы для изучения растительного патогена взаимодействия ^5. PTI индуцировано проникновение непатогенных бактериального штамма в листья. Семь часов спустя, бактериальный штамм, который либо вызывает болезнь, которая активирует или ETI проникли в зону перекрытия первоначальной зоны инфильтрации. PTI индуцированных первого проникновения может задержать или предотвратить появление клеточной смерти из-за второго инфильтрации вызов. С другой стороны, появление гибель клеток в области перекрытия прививки указывает распада PTI.

Четыре различных комбинаций индукторов PTI и бросить вызов прививки были стандартизированы (табл. 1). Анализ был проверен на не замолчать Н. benthamiana растений, которые служили в качестве контроля и растений замолчать для FLS2, что, согласно прогнозам, будет скомпрометирована в их способности развивать PTI.

протокол

Часть 1: рост растений и техническое обслуживание

Nicotiana benthamiana растений, используемых в анализе должна быть около 7 недель. Они должны быть сокращены по крайней мере 4-5 дней до анализа, чтобы удалить все ветви подмышечной и цветы. Это хорошая идея, чтобы удалить подмышечных ветви вскоре после их появления, чтобы сделать растения более управляемым.

Часть 2: бактериальные культуры

ДЕНЬ 1:

1. Пластины или культуры для всех штаммов, используемых в анализе инициируются в то же время. Для Pseudomonas sрр. которые включают в себя 2 индукторы и 3 штаммов вызов, полоса бактерий на КБМ чашки, содержащие соответствующие антибиотики из замороженных запасов глицерина (табл. 2). Небольшое количество бактерий должна быть распространена на центральную часть пластины. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 18-24 часов. Для Agrobacterium, начните культуральной жидкости в 2 мл LB из свежей пластинки и расти в течение ночи при 250 оборотах в минуту, 30 ° C.

ДЕНЬ 2:

2. Для Pseudomonas, добавьте 150-200 мкл жидкости КБМ для бактерий и их распространения по всей пластине, используя стерильный разбрасыватель стекла. Положите пластину обратно в инкубатор и дайте ему расти еще 20-24 часов. Там должно быть бактериальный газон на табличке на следующий день, указывая на хороший рост. Для Agrobacterium, начать вторичные культуры в около 5-10 мл LB с 20 acetosyringone мкМ и пусть растут в ночь на 20 часов при 250 оборотах в минуту, 30 ° C.

Часть 3: Подготовка установки для анализа

ДЕНЬ 2:

1. За день до анализа растения следует перенести в комнату на 22-24 ° С, ~ 35-40% относительной влажности и постоянного света.
2. Марк круги на листья, которые не менее 1,5 см в диаметре использованием густой черный маркер. От двух до четырех круги могут быть нанесены на лист. Круги должны быть хорошо разделены и, желательно, не пересекают крупные вены. Выберите хорошо расширены листьев. Избегайте старые листья или листья, которые жестко или толстой на ощупь и избежать маркировки кругов на нижней части листа.

Маркировка кругах день до эксперимента не является необходимым для протокола. Тем не менее, он экономит время, если Есть большое количество растений быть проанализированы, и делает его легче добиться точного времени между индукцией PTI и бросить вызов прививки.

Часть 4: Индукция PTI

ДЕНЬ 3:

1. Урожай клетки от пластины в 10 мМ MgCl ₂ для P. Циогезсепз и П. putida. Для Agrobacterium, центрифуги культуры, чтобы собрать клетки и ресуспендируют в 10 мМ MgCl ₂ + 10 мМ MES рН 5,6. Повторите центрифугирования и ресуспендирования в MgCl _{2-MES-решение.} Измерить оптическую плотность (ОП) клеток при 600 нм. Отрегулируйте ОР в финал требуемые значения, как описано в таблице 2. Pseudomonas должны быть, наконец, ресуспендируют в 10 мМ MgCl ₂ и Agrobacterium в MgCl _{2-MES-решение.} Общий объем 25 мл достаточно, чтобы привить около 40-50 точек.
2. Проникнуть PTI индукторы в заранее заполненных кругов на листьях использованием 1 мл needleless шприц. Запишите порядок, в котором растения проникли и точное время, когда проникновение было начато.

Часть 5: Вызов прививки

1. Подготовка P. syringae ру. помидор DC3000, DC3000 Pst Δ hopQ1-1 и Ps ру. tabaci на вызов, как описано в части 4.1 и Таблице 2.
2. Семь часов после индуктор инфильтрации, выполнить задачу проникновения в том же порядке растений, как индукция и было сделано. Как правило, точки на периферии первого круга прививка может быть использован как центр второй круг прививки. Если Есть несколько пятен на листьях, то убедитесь, что проникновение не перекрываются.
3. Пластина серийные разведения всех культур, используемых в анализе на КБМ или LB чашки, содержащие соответствующие антибиотики, чтобы определить точное количество КОЕ.

Часть 6: Подсчет очков для пробоя PTI

День 5:

1. Посмотрите на внешний вид клеточной смерти из-за ETI в места, которые были оспорены с Pst DC3000. Гибель клеток внутри области перекрытия инфильтрации указывается разбивка PTI и должны быть засчитан в качестве положительного фенотипа.

День 7:

2. Посмотрите на внешний вид клеточной смерти из-за болезни в места, которые были оспорены с Pst DC3000 Δ hopQ1-1 или Ps ру. Tabaci . Оценка для положительного фенотипа таким же образом, как описано в части 6.1.

При контрольных растений (которые не должны подвергаться риску для PTI) начинают проявлять гибель клеток в области перекрытия инфильтрация, прекратить любые дальнейшие наблюдения.

Часть 7: Представитель результаты

На рисунке 1 показан результат анализа, когда П. Циогезсепз был использован в качестве индуктора и Pst DC3000 как вызов.

Рисунок 1. P. Циогезсепз был проникли на N. benthamiana листьев (черный круг), чтобы вызвать PTI и 7 часами позже, пятно было оспорено с Pst DC3000 (белый круг). Растения для замолчать FLS2 показал распад ПТИ в регионе, где П. Циогезсепз был проникли (), как показано на гибель клеток. Контрольные растения, которые не были замолчать не показали гибель клеток в перекрывающиеся области из-за индукции PTI (B). Красные стрелки указывают на отсутствие или наличие гибели клеток в области перекрытия инфильтрации. Фотографии были сделаны через 2 дня после проникновения. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

PTI индуктор	Сотовые смерти вызывая проблемы	Природа клеточной смерти	Код
Pseudomonas флуоресцирующей 55	Pseudomonas syringae ру помидор (PST.) DC3000 6	ETI	Р / DC
P. putida KT2440	Pst DC3000	ETI	Стр / DC
П. Циогезсепз 55	Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6	Болезнь	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	P. syringae ру. tabaci 11528R	Болезнь	Агро / ПТАБ

Таблица 1: Комбинации PTI вызывающие и гибели клеток, вызывая микробов, используемых в анализе гибели клеток для PTI.

Штамм бактерий	Выбор среды	Заключительные OD, используемых в эксперименте	Корреспондент КОЕ / мл
П. Циогезсепз 55	КБМ ампициллин (100 мкг / мл)	0,5	1 х 10 9
P. putida KT2440	КБМ ампициллин (100 мкг / мл)	0,5	1 х 10 8
А. tumefaciens GV2260	Л. Б. рифампицин (100 мкг / мл)	0,5	5 х 10 8
Pst DC3000	КБМ рифампицин (100 мкг / мл)	0,02	2 х 10 7
Pst DC3000 Δ hopQ1-1	КБМ рифампицин (100 мкг / мл)	100 кратного разбавления до 0,1	1 х 10 6
P. syringae ру. tabaci 11528R	КБМ рифампицин (100 мкг / мл)	100 кратного разбавления до 0,1	1 х 10 6

Таблица 2: Условия культивирования и посевной уровней, используемых в анализе. OD и соответствующие уровни КОЕ может варьироваться от другой марки спектрофотометров.

Обсуждение

Гибель клеток основе анализа могут быть использованы для определения участия гена в ФТИ. Так, например, с потерей функции мутантов гена могут быть проверены с помощью этого теста. Из 4 комбинации индуктор и проблема прививок приведены в таблице 1, не исключено, что только одна комбинация может привести к фенотипу на Вашем предприятии фоне. Мы заметили, что растения замолчать для FLS2 показать распад ПТИ в Р / DC и Pf/Q1-1 комбинации индуктор и проблема прививок (табл. 1).

Очень важно, чтобы условия окружающей среды для анализа являются как можно ближе к описанным в части 3.1. Низкая влажность причины гибели клеток приступить слишком быстро, что делает анализ трудно забить. Если условия, описанные в наш протокол не работает в вашей лаборатории, то попробуйте изменить уровень индуктор или поставить под сомнение прививки. Другой параметр, который может быть изменен является разрыв во времени между индукцией и проблемы, хотя мы обнаружили, что более короткие временные промежутки вызвало анализа, чтобы сломать слишком быстро в контрольных растений.

Мы рекомендуем, чтобы по крайней мере 4-5 растений быть проверены в эксперименте и положительного фенотипа следует повторять по меньшей мере в 3-4 независимых экспериментов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730