从小鼠胚胎干细胞的造血干细胞的推导

摘要

该协议的细节从小鼠胚胎干细胞（ESC），并随后注入到致死剂量照射的的受体小鼠的造血干细胞移植的推导。简言之，电子调速器是有区别的胚体，然后用逆转录病毒HOXB4 OP9基质细胞和造血细胞因子共同培养的感染。

摘要

干细胞被定义为一个有能力的细胞自我更新和产生多个不同的后代。胚胎干细胞（ESC）上都来源于早期胚胎的囊胚differentiative能力的多能干。其巨大的differentiative潜力，使他们推断如何哄他们产生临床上有用的细胞类型为中心的许多研究的重点。成功，造血干细胞从小鼠ESC（HSC）的推导，最近已经完成，可以在这个视频协议的可视化。 HSC的，可以说是最临床上利用的细胞群，是用来治疗无数的造血系统恶性肿瘤和障碍。然而，许多患者可能会受益于HSC的治疗得不到合适的捐赠者。 ESC键可以为这些患者提供替代来源的HSC。以下协议，建立了从ESC - HSC，可以研究，并告知努力找出人类胚胎的HSC的基线。在这个协议中，ESC 6天市售的血清前筛选最佳的造血分化的胚状体（EBS）是有区别的。分化是再分解，与逆转录病毒HOXB4感染。感染的EB -源性细胞接种于OP9基质，派生从颅骨的M - CSF - / - 小鼠骨髓基质细胞系，并合作培养中存在的十天，促进细胞因子的造血。在这种合作文化，被感染的细胞大大扩大，在一代人造成了数百万个细胞100S异构池。然后，这些细胞可以用于救援和重建致死剂量照射的小鼠。

研究方案

分化的胚胎干细胞

1. 通过用ESC胰蛋白酶处理的胚胎干细胞（ESC）上收集的附近汇合瓶中。
2. 重悬细胞分化媒体5毫升，并转移到非明胶涂层的T25。 37 ° 45分钟的彗星。检索上清，通过离心收集细胞。
   
   注：小鼠胚胎成纤维细胞从ESC文化（MEFs）容易附着到非明胶涂层的T25，从而从文化耗尽在此期间电镀步骤。 如果你不培养你的人事编制小组委员会上MEFs，你可以跳过前板 。
   
   
3. 悬浮MEF耗尽ESC 333333 cells/50毫升分化媒体。这种集中，结果在100 ESC/15毫升。
4. 使用多通道移液器，板100 cells/15毫升下降15厘米²培养皿板ESC。 8通道移液器，你应该能够适合滴每盘约18-22行（约每盘5毫升）。
   
   注：此协议，2-5 15厘米²滴的菜就绰绰有余了，应该产生2-5 6 × ^{10 6}天的EB -源性细胞 。
   
   
5. 轻轻翻转板倒置滴。孵育于37℃5％CO _2的 48小时。
6. 池滴，轻轻摇动板和转移至15 mL锥形管。 4-6毫升的PBS冲洗板，并添加到相同的15 mL锥形。
   
   注意：您可能池五个悬滴板。 EBS将增长，因为他们继续分化，如果他们过于集中，他们往往形成大的团块。
   
   
7. 允许汇集胚比重（约10分钟）定居。不扰民胚吸上清。轻轻地悬浮在10毫升分化媒体转移到非贴壁10厘米的培养皿板。
8. 置于培养皿板板振动筛在50 rpm和孵化，在37℃，5％的_CO 2 。
9. 24小时后（分化），旋流板集中在培养皿中心胚。仔细交流媒体的50％（5毫升）5 mL新鲜分化媒体。返回板孵化器为两天。

EB分离和MSCV HOXB4 - IRES - GFP的感染

1. 分化6天，胚转移到15 mL锥形管。允许通过重力来解决。
2. 吸媒体和重新悬浮于10 mL PBS。允许胚，以安置受重力。吸PBS。
3. 加入250毫升分解酶的结构和1毫升PBS。在37℃水浴孵育20分钟，偶尔旋流管混合酶和EBS。
4. 添加8 mL的酶分解缓冲区。
5. 磨碎混合使用5毫升吸管，直到胚是完全分离的（约10倍;过度移液器将增加内的EB -派生的细胞制备的死亡）。
   1. 混合物，将成为与细胞分化游离于多云。
   2. 配售期间trituration吸管针尖对锥管底部，将创建一个剪切力，这将大大方便分解。
6. 通过离心收集细胞。
7. 悬浮在5毫升10％IMDM派生的EB -细胞计数采用台盼蓝拒
   
   注：至第四天和分化的第六天，分化气蚀而导致在大量的细胞凋亡和细胞death.Thus，在第六天，超过30％的EB -源性细胞可能与台盼蓝染色 。
   
   
8. 悬浮的EB -派生的细胞，在10万细胞/ 2 mL的10％IMDM +病毒上清这样一个MOI 5-10 achieved.Add硫酸鱼精蛋白的终浓度为8毫克/毫升。
   
   注：准备足够的EB /病毒上清混合板4个6孔板（假设2毫升/）。
   
   
9. 板2毫升EB /病毒上清混合，每孔4个6孔板OP9基质细胞（见下文）镀前。
10. 板在室温下在2500 RPM离心90分钟。传输板，以孵化器在37℃5％的CO _2。
11. 4-6小时后，收获板上清，留在暂停通过离心收集任何潜在的细胞。
12. 悬浮颗粒（可能是小）在48 mL 10％的IMDM +细胞因子。分配2毫升/到原来的4个6，以及在其中进行感染，并收集上清板块的再悬浮。
    
    注意：请务必准备10％IMDM +细胞因子在使用时的新鲜。
    
    
13. 在37℃，5％的_CO 2七天板。菌落应明显第四天感染后，大和良好的第七天。一个强大的扩展应产量/七天40-60殖民地。
14. 在七天后感染，收集和池与胰蛋白酶处理所有井的所有细胞（包括OP9基质）。
    
    注意：不要丢弃在胰蛋白酶treatment.At这一点在文化聘用的上清或PBS清洗，有些殖民地可能只是笼统地贴壁，并有许多细胞floasuspension.Collect和池所有的清洗和上清婷，以确保没有潜在的有价值的的细胞被丢弃。
    
    
15. 悬浮细胞，在8毫升新鲜的10％IMDM +因子。分配到四个T75烧瓶2毫升/烧瓶。到每个烧瓶中加入13毫升10％IMDM +的细胞因子。在37 ° C 5％CO ₂为3天（共10天感染）。

OP9基质的文化和电镀

1. 根据20％的A - MEM标准协议，维护OP9基质。 OP9细胞生长时会发生变化，以汇合的属性。始终在80％左右，不超过1:3分割汇合分裂。
2. 24小时前一天六个派生的EB - MSCV - HOXB4 - IRES - GFP的，板块25,000 OP9细胞/以及4个6孔板在20％A - MEM细胞的感染。

收集，分离和移植

1. 收集扩大OP9基质细胞为10天通过与胰蛋白酶处理。计数细胞。
   
   注意：不要丢弃上清液或PBS洗涤受雇期间胰蛋白酶处理。在这点文化，有些殖民地可能只是笼统地贴壁，并有许多细胞在suspension.Collect和池浮动所有的清洗和上清，以确保没有潜在的有价值的的细胞被丢弃。
   
   注：一个应该产生良好的扩展40-50 × 10 ⁶细胞/原来的6孔板感染之间，共为160-200 × ^{10 6}细胞， 。
   
   
2. 细胞可能是通过磁珠选择或流式细胞仪，根据标准的技术，这一点在协议中分割。
3. 移植，提供细胞通过眼窝或尾静脉注射到一个分割剂量照射2.5小时的9.25 GY Rag-2/gc缺乏能力的受助人（体重15-22克之间）。除了。
   
   注：关键是，照射时间在15-22克之间的动物体重下降。 ，如果他们都超过22克，9.25 GY不会是一个足够的照射剂量，以确保适当的消融和细胞可能无法调解致死量照射和/或嫁接的造血车厢救援 。 如果较大的动物移植，适当的照射剂量，必须确定实验 。
   
   
4. 最低剂量的2-5 × 10 ⁶细胞/动物是必需的，以保证救援致死量照射。如果分馏细胞，注入2-5 × 10 ⁶细胞现金等价物（ 例如 ，如果感兴趣的人口占10％的普通细胞池，注入2-5 × ¹⁰ 5细胞/动物） 。
   
   注意：如果注射> 2 × 10 ⁶细胞，经尾静脉注入，以避免形成畸胎瘤在轨道上，这可能会导致细胞高复古轨道交付。
   
   
5. 保持RAG - 2 ^- GC ^{/ - / - / -}蒸压笼中的不足之处者。根据“清洁”的动物设施，移植后的动物，可能需要5周后致命的辐射酸化水或Trimethiprim Sulfasoxazole（Septra）的管理。
   
6. 期望在外周血移植后3周> 90％的GFP + ES衍生的白细胞。植入应多血统，尽管淋巴细胞被称为逆转录病毒HOXB4 IRES - GFP的沉默。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc