マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

要約

このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。

要約

幹細胞は、両方の自己複製と生成する複数の分化した子孫の能力を持つ細胞として定義されています。胚性幹細胞（ESC）は、初期胚の胚盤胞に由来し、分化能力に多能性がありますされています。その広大な分化の可能性はそれらの臨床的に有用な細胞型を生成するために、それらを同軸にする方法推理を中心に多くの研究の焦点を行っています。マウスESCからの造血幹細胞（HSC）の成功導出は、最近行われており、このビデオのプロトコルで可視化することができます。 HSC、間違いなく最も臨床的に利用された細胞集団は、造血悪性腫瘍や疾患の無数の治療に使用されています。しかし、HSC治療の恩恵を受ける可能性がある多くの患者は、適切なドナーへのアクセスを欠いている。 ESCは、これらの患者のためのHSCの代替ソースを提供することができます。以下のプロトコルは、ESC - HSCの検討や人間のESCからHSCを分離するための努力を知らせることができるベースラインを確立します。このプロトコルでは、ESCは、市販の血清に対して事前にスクリーニングに最適な造血分化の6日間胚様体（EB）として区別されます。 EBはその後解離し、レトロウイルスHoxB4に感染している。マウス、および10日間のサイトカインを促進する造血の存在下で共培養 - 感染したEB由来細胞はOP9ストローマ、M - CSF - /の頭蓋冠由来する骨髄間質細胞株上にプレーされています。この共培養時には、感染細胞は、世代内のセルの数百万数百の異種プールを結果として、大幅に拡大する。これらの細胞は、致死量放射線照射したマウスを救出して再構成するために使用することができます。

プロトコル

胚性幹細胞の分化

1. ESCトリプシン処理によって胚性幹細胞（ESC）の近くにコンフルエントにフラスコを収集する。
2. 分化培地を5 mLで細胞を再懸濁し、非ゼラチンコートT25に転送する。 37℃を45分間。上清を取得し、遠心分離を介して細胞を集める。
   
   注：ESC培養物からのマウス胚性繊維芽細胞（MEF）は、非ゼラチンコートT25に容易に接続するため、このめっき工程中に培養液から枯渇している。あなたのMEF上で培養してESCをされていない場合は、事前にプレートをスキップすることができます。
   
   
3. 333333 cells/50 mLの分化のメディアで再懸濁し、MEF -枯渇ESC。この濃度は100 ESC/15 mLの結果。
4. 使用して、マルチチャンネルピ ​​ペッター、15 cm ^2のペトリ皿に100 cells/15 mLのドロップでプレートESC。 8チャンネルピペッターを使用して、プレートあたりの滴の18から22行（プレートあたり5ミリリットル程度）について、合うものでなければなりません。
   
   注：このプロトコルでは、滴の2-5 15センチメートル²皿は十分以上になると2-5 × 10 ⁶ 6日目EB由来細胞を得られるはず。
   
   
5. ゆっくりと低下を反転させるためにプレートを反転させる。 ° C、5％CO ₂で48時間37℃でインキュベートする。
6. プールは、静かにプレートし、15 mLコニカルチューブへの転送を渦巻くことでドロップします。 PBSの4-6 mLでプレートをすすぎ、同じ15 mLコニカルに追加します。
   
   注：最大5つのハンギングドロッププレートまでプールすることがあります。彼らは差別化を続け、彼らはあまりにも集中している場合、彼らは大きな塊を形成する傾向があるとして、EBは成長します。
   
   
7. プールされたEBSは重力（約10分）によって沈殿することができます。 EBSを乱すことなく上清を吸引除去する。静かに10mLの分化のメディアと10 cmに転送非接着性のペトリ皿に再懸濁します。
8. 37 50rpmのインキュベートでプレートシェーカー上に置いてペトリ皿° C、5％CO _2。
9. 24時間後（分化4日目）、ペトリ皿の中央にEBSを集中するスワールプレート。慎重に交換5mLの新鮮な分化のメディアとメディアの50％（5mL）を。さらに2日間インキュベーターにプレートを返します。

MSCV - HoxB4 - IRES - GFPとEB解離と感染症

1. 分化の6日目に、15 mLコニカルチューブにEBSを転送する。重力によって解決することができます。
2. 10mLのPBSでメディアを再懸濁しますを吸引除去する。 EBSは重力によって再定住することができます。 PBSを吸引除去する。
3. 250mLの解離酵素ミックスし、1 mLのPBSを追加。時折酵素とEBSを混在させるチューブを渦巻いて、20分間37℃の水浴でインキュベートする。
4. 8 mLの酵素を含まない解離緩衝液を追加します。
5. EBSは完全に解離されるまで混合物が（;過度のピペッティングは、EB由来細胞調製物中で死を増加させる約10倍）を5 mLのピペットを使用してひいて粉にする。
   1. 混合物は、EBSが解離などの細胞と濁ってくるでしょう。
   2. 粉砕中にコニカルチューブの底にピペットチップを配置することで大幅に解離を促進するせん断力を作成します。
6. 遠心分離を介して細胞を集める。
7. 再懸濁し、10％IMDM 5mLに細胞をEB由来とトリパンブルー排除を用いてカウント
   
   注：4日目と分化の6日間、EBSは上向きEB由来細胞の30％、6日目で、アポトーシスと細胞のdeath.Thusの大量のどの結果を空洞を作るには、トリパンブルーで染色することがあります。
   
   
8. 再懸濁し、EB由来の100,000個の細胞における細胞/ 2 mlの10％IMDM +ウイルス上清などそのMOI 5〜10が8 mg / mLの最終濃度に硫酸プロタミンをachieved.Addている。
   
   注：プレート4つの6 -ウェルプレート（ウェル2 mLの/と仮定して）するのに十分なEB /ウイルス上清ミックスを調製する。
   
   
9. プレート2 mLのEB /ウイルス上清ミックスウェルあたりのOP9ストローマ細胞（下記参照）で事前にメッキ4個の6ウェルプレート。
10. 90分間室温で2500rpmでプレートを遠心分離します。 37℃インキュベーターにプレートを転送℃、5％CO _2。
11. プレートから上清を4〜6時間後、収穫し、遠心分離を介して懸濁液中に残っている潜在的な細胞を集める。
12. 48 mlの10％IMDM +サイトカインでペレットを再懸濁します（小さくなるかもしれない）。 2 mLの/ウェルの実行された、上清を回収した感染で元の4つの6ウェルプレートに再懸濁を分注する。
    
    注：必ず、使用時に+サイトカイン新鮮な10％IMDMを準備。
    
    
13. ° C、5％CO ₂七日間37℃培養する。コロニーは4日後の感染と大と7日目では、整形式で明らかなはずである。健全な拡大には/よく7日目に40から60コロニーをもたらす必要があります。
14. 7日目、感染後に、トリプシン処理によりすべてのウェルからのすべてのセルを（OP9間質を含む）の収集とプール。
    
    注：上清またはトリプシンtreatment.Atこの時点文化の中に採用さPBS洗浄を廃棄しないで、いくつかのコロニーは緩く付着している可能性があり、多くの細胞がfloaがありますsuspension.Collectとプールのすべての洗浄上清中のティンは潜在的に価値のあるセルは廃棄されていないことを確認する。
    
    
15. 8 mLの新鮮な10％​​IMDMで再懸濁し、細胞+サイトカイン。 four T75フラスコに2 MLS /フラスコを配布します。各フラスコに、13 MLS 10％IMDM +サイトカインを追加。 37 ° C 5％3日間CO _2（10日間の感染後の合計）。

OP9間質の文化とメッキ

1. 20パーセント- MEMでの標準プロトコルにしたがってOP9間質を維持する。コンフルエントに増殖した場合にOP9細胞は、プロパティを変更します。常にそれ以上一時03分より、分割で80％コンフルエントで分割。
2. 24時間前MSCV - HoxB4 - IRES - GFP、20％- MEMで25000 OP9細胞/ウェルのプレート4つの6 - ウェルプレートで6日目EB由来細胞の感染に。

収集、分別及び移植

1. トリプシン処理を経由して十日間OP9ストロマに展開細胞を集めます。細胞を数える。
   
   注意：トリプシン処理の間に用いられる上清またはPBS洗浄を破棄しないでください。文化のこの時点で、いくつかのコロニーは緩く付着している可能性があり、潜在的に価値のあるセルは廃棄されていないことを保証するためにsuspension.Collectとプール内のすべて洗浄し、上清を浮遊し、多くの細胞があります。
   
   注：良い展開が160から200 × 10 ⁶細胞の合計、40〜50 × 10 ⁶細胞/感染オリジナル6穴プレートの間に得 ​​られるはず。
   
   
2. 細胞は、プロトコルのこの時点では標準的な技術に係る磁気ビーズを選択またはFACSを経由して分画することができる。
3. 移植のために、照射2.5時間の9.25 Gyの分割線量を受けるRag-2/gc欠損の受信者（15-22グラムの重さ）に眼窩または尾静脈注射を介して細胞を提供する。離れて。
   
   注：これは動物の体重は、照射の時に15〜22グラムの間に落ちることが重要です。彼らは22グラムより大きい場合、9.25 GYは、適切なアブレーションを確保するために、細胞が致死照射および/ ​​または生着造血コンパートメントから救助を仲介することはできません照射の十分な投与量にはなりません。大型動物を移植する場合、適切な照射線量を実験的に決定する必要があります。
   
   
4. 2月5日× 10 ⁶細胞/動物の最低投与量は致死照射から救助を保証するために必要です。細胞を分画する場合、2-5 × 10 ⁶細胞に相当する（ 例えば、関心の人口は、細胞の未分画プールの10％を表す場合は、2-5 × 10 ⁵細胞/動物を注入）注入する。
   
   注：> 2 × 10 ⁶細胞を注入した場合、常に細胞の高い数字が眼窩配信されたときに生じる可能性が、軌道上での奇形腫形成を避けるために、尾静脈を介して注入する。
   
   
5. 維持RAG - 2 ^{- / -} / GC ^{- / -}オートクレーブケージの欠乏の受信者。動物施設の"清潔"に応じて、移植後の動物は致死放射線は、次の5週間酸性の水またはTrimethiprim - Sulfasoxazole（Septra）の投与が必要な場合があります。
   
6. 3週間後の移植では末梢血で> 90％のGFP + ES由来の白血球を期待する。リンパ球がレトロウイルスHoxB4 - IRES - GFPを黙らせるために知られているが生着は、多系統にする必要があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc