Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Özet

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Özet

Bir kök hücre kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanan, hem kendini yenilemek ve birden fazla farklılaşmış döl oluşturmak. Embriyonik kök hücreler (ESC), erken embriyo blastosist türetilmiştir ve pluripotent differentiative yeteneği vardır. Onların engin differentiative potansiyel klinik olarak yararlı bir hücre türleri oluşturmak için onları nasıl ikna edebilmeyi çözmekten merkezli birçok araştırmanın odak yaptı. Fare ESC hematopoietik kök hücrelerin (HSC) başarılı türetme tamamlanmıştır ve bu video protokolde görüntülendi olabilir. HSC, tartışmasız en çok klinik istismar hücre popülasyonu, hematopoetik maligniteler ve bozukluklar sayısız tedavi etmek için kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastada HSC tedaviden yarar olabilir uygun donör erişim yoksundur. ESC, bu hastalar için HSC alternatif bir kaynak sağlayabilir. Aşağıdaki protokol ESC-HSC okudu ve insan ESC HSC izole etmek için çabalar bilgilendirmek edilebileceği bir temel kurar. Bu protokol, ESC, piyasada bulunan serum ön elemeden optimal hematopoetik farklılaşma 6 gün embriyoid organları (EBS) olarak ayırt edilirler. EBS sonra ayrışmış ve retroviral HoxB4 ile enfekte. Fare ve ortak kültür varlığı on gün sitokinler teşvik hematopoez - Enfekte EB-elde edilen hücreler, M-CSF / calvaria türetilmiş bir kemik iliği stromal hücre hattı OP9 stroma kaplanmıştır. Bu ko-kültür sırasında, enfekte olan hücreleri nesil 100'ün üzerinde milyonlarca hücreden heterojen bir havuz, büyük ölçüde genişletmek. Bu hücreler daha sonra kurtarma ve sulandırmak ölümcül ışınlanmış fareler için kullanılabilir.

Protokol

Embriyonik Kök Hücre Farklılaşması

1. ESC tripsin ile tedavi ile embriyonik kök hücreler (ESC) yakın bir konfluent balon toplayın.
2. Farklılaşma medya 5 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve olmayan bir-jelatin kaplı T25 transfer. 37 ° C'de 45 dakika için. Süpernatant Al ve santrifüj yoluyla hücreleri toplamak.
   
   Not: ESC kültürlerden gelen Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olmayan jelatin kaplı T25 kolayca tutunur ve böylece bu kaplama adımı sırasında kültür tükenmiş. MEFS üzerinde kültür sizin ESC değilseniz, ön-plaka atlayabilirsiniz.
   
   
3. 333.333 cells/50 ml Farklılaşma medyada yeniden süspanse MEF-tükenmiş ESC. Bu yoğunlaşma, 100 ESC/15 ml sonuçlanır.
4. Kullanımı çok kanallı pipet, cells/15 15 cm ² petri tabak 100 mL damla plaka ESC. 8 kanallı pipet ile, plaka başına 18-22 satır (plaka başına 5 ml hakkında) damla hakkında sığdırmak mümkün olmalıdır.
   
   Not: Bu protokol, damla 2-5 15 cm ² yemekleri yeterli olandan daha fazla olacak ve 2-5 x ¹⁰ 6 gün altı EB-kaynaklı hücrelerin boyun eğmek zorundadır .
   
   
5. Damla yavaşça ters plakaları çevirin. Için 37 ° C'de% 5 CO ₂ ile 48 saat inkübe edin .
6. Havuz yavaşça 15 ml konik tüp plakaları ve transfer dönen düşer. 4-6 mL PBS plakalar durulayın ve 15 ml konik aynı eklemek.
   
   Not: beş damla plakalar asılı havuzu olabilir. EBS farklılaştırmaya devam ederler ve onlar da yoğunlaştığı takdirde büyük öbekler şeklinde eğilimi artacaktır.
   
   
7. Ağırlık (yaklaşık 10 dakika) tarafından toplanmış EBS yerleşmek için izin verin. EBS rahatsız olmadan süpernatant aspire. 10 ml Farklılaşma medya ve 10 cm yapışmaz petri tabak transfer yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin.
8. 50 rpm ve 37 ° inkübe plaka çalkalayıcı yerleştirin petri tabak ° C% 5 CO _2.
9. 24 saat sonra (farklılaşma dört gün), girdap plakaları petri merkezinde EBS konsantre. Dikkatle döviz, 5 ml taze Farklılaşma Medya ile medya% 50 (5 ml). İki gün daha inkübatör plakasını dönün.

MSCV-HoxB4-IRES-GFP ile EB disosiasyon ve enfeksiyon

1. Farklılaşma altı günü günde 15 ml konik tüp EBS aktarın. Yerçekimi ile yerleşmek için izin verin.
2. 10 ml PBS içinde aspire medya ve tekrar süspansiyon haline getirin. EBS yerçekimi ile yerleşmek için izin ver. Aspire PBS.
3. 250 ml disosiasyon enzim karışımı ve 1 mL PBS ekleyin. Bazen enzimler ve EBS karıştırmak için tüp dönen, 37 ° C su banyosunda 20 dakika inkübe edin.
4. 8 mL enzim disosiasyon tampon ekleyin.
5. EBS tamamen ayrışmış kadar karışımı (aşırı pipetleme EB-kaynaklı hücre hazırlama içinde ölüm artacak yaklaşık 10 kez) 5 ml pipet kullanarak Karışım.
   1. Karışım EBS ayrıştırmaları olarak hücreleri ile bulutlu olacak.
   2. Öğütme sırasında konik tüp alt karşı pipet yerleştirmek disosiasyon büyük ölçüde kolaylaştıracak bir kuvvet oluşturacaktır.
6. Santrifüj yoluyla hücreler toplayın.
7. 5 ml% 10 IMDM içinde süspanse edin hücreleri EB-türetilmiş ve tripan mavisi dışlama kullanarak saymak
   
   Not: farklılaşma gün dört ve altı gün arasında, EBS cavitate, altı günde, apoptoz ve hücre death.Thus büyük miktarda sonuçları EB-türetilen hücrelerin% 30 yukarı tripan mavi ile leke olabilir.
   
   
8. Süspanse edin EB-elde edilen 100.000 hücre hücre / 2 mL% 10 IMDM + viral supernatant gibi bir İçişleri Bakanlığı 5-10 nihai konsantrasyonu 8 mg / ml protamin sülfat achieved.Add.
   
   Not: plaka dört adet 6-iyi levhalar (2 ml / varsayarak) yeterli EB / viral supernatant karışımı hazırlayın .
   
   
9. Levha 2 mL EB / viral supernatant karışım başına iyi OP9 stroma hücreleri (aşağıya bakınız) ile ön kaplama dört 6 kuyucuğu.
10. 2500 devirde 90 dakika süreyle oda sıcaklığında plakaları santrifüjleyin. 37 ° inkübatör plakaları transfer ° C,% 5 CO _2.
11. 4-6 saat sonra, plakalardan supernatant hasat ve santrifüj yoluyla durdurulması kalan herhangi bir potansiyel hücreleri toplamak.
12. 48 ml% 10 IMDM yeniden süspanse pellet (küçük olabilir) + sitokinler. Uygulama 2 mL / enfeksiyon yapıldı ve süpernatant toplanan edildiği orijinal dört 6-kuyucuğu için tabanda.
    
    Not: Sürekli kullanım sırasında taze% 10 IMDM + sitokinler hazırlar.
    
    
13. Plakalar için 37 ° C'de% 5 CO ₂ ile yedi gün inkübe edin . Kolonileri gün dört sonrası enfeksiyon ve büyük ve yedi gün iyi biçimli görünür olmalıdır. Sağlam bir genişleme / yedi günde 40-60 koloniler boyun eğmek zorundadır.
14. Gün yedi post-enfeksiyon, tripsin ile tedavi bütün kuyulardan (OP9 stroma dahil) tüm hücreleri toplamak ve havuz.
    
    Not: süpernatant veya tripsin treatment.At Bu noktada kültür sırasında istihdam PBS yıkar atmayın, bazı koloniler sadece gevşek yapışmış olabilir ve birçok hücre floa vardırting suspension.Collect ve havuz tüm yıkar ve supernatant potansiyel olarak değerli hücreler atılır sağlamak.
    
    
15. 8 ml taze% 10 IMDM yeniden süspanse hücreler + sitokinler. 2 mL / şişesi dört T75 şişeler içine dağıtın. Her balona ilave bir 13 mL% 10 IMDM + sitokinler ekleyin. 37 ° ° C'de üç gün için% 5 CO ₂ (toplam on gün sonrası enfeksiyon).

Kültür ve kaplama OP9 stroma

1. % 20 a-MEM standart protokollere göre OP9 stroma koruyun. Confluency için yetiştirilen OP9 hücrelerin özellikleri değişecektir. Her zaman 1:3 'ten daha fazla bölünmüş confluency% 80 ayrıldı.
2. 25.000 /% 20 a-MEM dört adet 6-iyi plakaları MSCV-HoxB4 IRES-GFP, plaka OP9 hücreleri ile altı gün EB-kaynaklı hücrelerin enfeksiyonu önce 24 saat.

Koleksiyon, bölme ve transplantasyon

1. Tripsin ile on gün ile tedavi için OP9 stroma hücreleri genişletilmiş toplayın. Hücreleri saymak.
   
   Not: süpernatant veya PBS atmayın tripsin tedavisi sırasında istihdam yıkar. Kültür, bu noktada, bazı koloniler sadece gevşek yapışmış olabilir ve suspension.Collect ve havuz, potansiyel olarak değerli hücreler atılır olduğundan emin olmak için tüm yıkar ve supernatant yüzen birçok hücre vardır.
   
   Not: iyi bir genişleme toplam 160-200 x 10 ⁶ hücre, 40-50 x 10 ⁶ hücre / enfekte orijinal 6-plaka arasında boyun eğmek zorundadır.
   
   
2. Hücreler protokolde bu noktada standart tekniklere göre manyetik boncuk seçimi veya FACS ile fraksiyone olabilir.
3. Transplantasyonu için retro-orbital veya kuyruk damar enjeksiyonu ile hücreler, ışınlama 2.5 saat 9.25 ji bölünmüş bir doza maruz Rag-2/gc eksik alıcıları (15-22 arasında gram ağırlığında) sunuyor. dışında.
   
   Not: hayvanların kilo ışınlama sırasında 15-22 gram arasında kalan KRİTİK. 22 gramdan büyük ise, uygun ablasyon 9.25 ji sağlamak ve hücreleri öldürücü radyasyon ve / veya aşılamak hematopoetik bölmesi kurtarma aracı olmayabilir yeterli doz ışınlama olmaz. Büyük hayvanların nakli, uygun ışınlama dozu deneysel olarak tespit edilmelidir.
   
   
4. 2-5 x 10 ⁶ hücre / hayvan en az bir doz öldürücü ışınlama kurtarma garanti etmek için gereklidir . Hücreleri fraksiyonasyon ise, 2-5 x 10 ⁶ hücre eşdeğerleri (örneğin hücre fraksiyone olmayan havuz ilgi nüfusunun% 10 temsil ediyorsa, 2-5 x 10 ⁵ hücre / hayvan enjeksiyon) enjekte edilir.
   
   Not:> 2 x 10 ⁶ hücre enjekte DAİMA yüksek sayıda hücre retro-orbitally teslim edildiğinde neden olabilir yörüngede, teratom oluşumunu önlemek için kuyruk damar yoluyla enjekte.
   
   
5. Koru Rag-2 ^{- / - /} gc ^{/ -} otoklavlanmış kafeslerde eksik alıcıları. Hayvan tesisi "temizlik" bağlı olarak, transplantasyon sonrası hayvanların ölümcül radyasyon izleyen 5 hafta boyunca asitlendirilmiş su veya Trimethiprim Sulfasoxazole (Septra) verilmesi gerekebilir.
   
6. Transplantasyon sonrası 3 hafta periferik kan>% 90, GFP + ES-türetilen lökosit bekliyoruz. Lenfositler retroviral HoxB4 IRES-GFP susturmak için Aşı bilinmesine rağmen, çok soyundan olmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc