审核端粒G -悬结构锥虫布氏</em

摘要

端粒是染色体的稳定至关重要，并介导的端粒酶的端粒维持端粒G -悬结构是必不可少的。最近，我们通过两种方法检测端粒G -悬结构锥虫布氏，这是原生 - 凝胶杂交和连接介导的引物延伸，这将是描述。

摘要

端粒的G -悬结构已被确定在许多真核生物，包括酵母，脊椎动物和布氏锥虫。它作为基板从头端粒DNA合成的端粒酶，因此，重要的端粒维持 T 。 布氏是一种原生动物寄生虫引起的睡眠疾病在人类和牛的那加那病。一旦被感染的哺乳动物主机， T.定期交换机布氏细胞的表面抗原，以逃避宿主的免疫攻击。我们最近表明的T.布氏端粒的结构起着至关重要的作用，在调控的表面抗原基因的表达，这是 T的关键布氏的发病机制。然而，T.布氏端粒的结构还没有被广泛研究，由于这个专门的结构分析方法的局限性。我们现在已经成功地通过在凝胶杂交和连接介导的引物延长端粒G -悬结构， 在 T核苷酸测定端粒终端适配器结扎方法检查方法的原生布氏细胞。在这里，我们将详细描述了协议，并比较其不同的优势和局限。

研究方案

1。检测T。布氏端粒G -悬使用母语-凝胶杂交³

原理（图1）：在自然条件下，结束标记_{（CCCTAA）4（TELC）}寡核苷酸探针只能杂交的单链端粒G -悬地区。杂交强度悬的长度成正比。变性，中和后，相同的探测器将能够杂交整个端粒区域。杂交强度代表总端粒DNA量和可用于装载控制。这个实验的两个标准控制杂交使用末端标记_{（TTAGGG）4（TELG）}寡核苷酸探针，它应该不会产生任何信号为T 。 布氏细胞不会有端粒的C型悬结构，以及对待具体3' -单链外切酶，如埃克索我或埃克索T的基因组DNA，以杂交之前，应消除本地TELC杂交信号。

第1步。准备DNA的脉冲场凝胶电泳（PFGE）插头

将脉冲电泳分离完整的染色体。因此，基因组DNA作为DNA的插头准备。

1. 开始用100毫升的血液形成细胞（1.5 -2万细胞/ mL）或20毫升的procyclic细胞（10万细胞/ mL）。
2. 溶解1.6％低熔点（LMP）的琼脂糖在L缓冲液（0.01 mol三•CL pH值7.6，0.02 M氯化钠，0.1 M EDTA pH值8.0），并保持它温暖，在50 ° C.
3. 离心收集细胞在1.5 krpm，4℃10分钟。删除与L缓冲到终浓度为5万细胞/ mL上清和悬浮细胞沉淀。
4. 细胞悬液，在42-50 ° C孵育10分钟。
5. 加入1体积LMP琼脂糖1细胞的体积。充分混匀，但很快。
6. 分装85μL细胞悬液，以每一个一次性的插件模具（BioRad公司）以及。
7. 经过5-10分钟，或直至插头是凝固的，转让插入15 m​​L锥形管，用5 mL大号缓冲/ 1％Sarkosyl。加入100μL250 mg / mL的蛋白酶K或蛋白酶K粉捏，拌匀，孵育50 ° 48个小时的彗星。
8. 丢弃的缓冲区，用5毫升的L缓冲插头两次重复蛋白酶K消化48小时。新鲜的大号缓冲区清洗插头了。商店插头在L缓冲液在4 ° C。这些插头应使用2个星期内。

第2步。不同的完整的T 。 布氏染色体使用脉冲场凝胶电泳

• 准备琼脂糖凝胶
  1. 准备2-3 0.5 × TBE缓冲液和凝胶运行室的一名厨师DRII（BioRad公司）单位转移到大号。设置运行温度，启动水泵，然后开始冷却装置。
  2. 准备在0.5 × TBE缓冲液100毫升1.2％琼脂糖凝胶。酷琼脂糖而设立的凝胶托盘。
  3. 决定看样订货。请记住，包括DNA标准。干梳和它在一个平面上奠定。每个DNA插件放置到适当的齿。过度缓冲吸删除这样的插件会粘到牙齿周围的DNA插头。
  4. 倒入琼脂糖凝胶不插入梳子。让降温到40-50℃（几分钟），慢慢地进入凝胶的附加插头插入梳子。确保插头不滑出梳子。让凝胶巩固。从凝胶中取出梳子缓慢。
• 脉冲场凝胶电泳
  运行在一个厨师DRII单位凝胶：2.5伏/厘米，700 S - 1500小号脉冲，在12 ° C为120小时。

第3步。染色和destain琼脂糖凝胶

1μg/ mL的0.5 × TBE在室温溴乙锭在1小时凝胶染色，然后在0.5 × TBE没有乙锭与温和的摇摆为1小时的甲基溴。以凝胶的图片。

第4步。干琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶放在两层3毫米的Whatman纸，并用保鲜膜覆盖的凝胶。干凝胶在室温（凝胶不应该加热超过50 ° C，以避免任何的DNA样本变性）。分别为2和4小时的干燥后更换用干的湿的Whatman论文。保持干燥，直到凝胶完全干燥。这可能需要通宵取决于干燥器。

第5步。标记寡核苷酸探针

1μL50纳克/微升TELC或TELG寡核苷酸1μL10 ×多聚核苷酸激酶（PNK）缓冲液，5μL的混合γ[32P] ATP 2μL，DDH ₂和1μLT4 PNK。在37 ° C为1小时。反应混合物中加入90μLTNES缓冲区（10毫米三氯，pH值8.0，氯化钠100毫米，10毫米EDTA，pH值8.0，1％SDS）。

虽然标签oligoes，准备一个G - 25柱：投入3毫升注射器一些玻璃棉和它紧紧与枪头的东西。经Sephadex G - 25罚款（autocl填充注射器aved在TE）3毫升大关。让解决重量。为了净化探针：负载探头列的顶部。洗700 TNES缓冲液，洗脱600μLTNES缓冲区。另外，净化使用一个小型的快速旋转探针™列（罗氏应用科学部）。

第6步：杂交

1. 简言之湿干凝胶在蒸馏水洗去任何的Whatman纸卡凝胶
2. 杂交袋的凝胶，并添加20毫升hybridiztion缓冲区（0.25米娜₂ HPO ₄ PH7.2; 1毫米EDTA; 7％SDS，1％BSA，通过0.22微米过滤器过滤）。水浴中孵育50℃，温和的摇摆至少1小时。
3. 取出预杂交缓冲。煮沸5分钟，探针，并把它添加到25毫升新鲜的杂交缓冲液，过滤消毒用0.22μm的注射器过滤器的组合，直接添加的杂交组合杂交袋。密封袋浅容器用温水和地点。将整个容器的入水洗澡。在50℃过夜孵育，用温和的摇摆。
4. 切在杂交袋的小开。倒出尽可能多的杂交组合，并保存在50 mL锥形管。保持在-20 ° C冷冻探头从杂交袋中取出凝胶，并把它在一个容器中。
   
   在此步骤中的一切都将热，需要彻底清洗（长凳上，屏幕，剪刀，其他手续。请一定要戴双层手套！！
5. 在30分钟的4 × SSC洗涤凝胶在50 ° C。更换新鲜的缓冲液洗，重复两次。
6. 洗4 x SSC/0.1％的SDS凝胶在50 ° C。
7. 凝胶放在了一块3毫米的Whatman纸，轻轻擦干凝胶。
8. 用保鲜膜包裹的凝胶和揭露〜3天，以phosphorimager
9. 扫描的phosphorimager
10. 在变性缓冲液在室温下（1.5 M氯化钠，0.5 M的氢氧化钠）中孵育30分钟凝胶
11. 凝胶和缓冲液中清洗（3 M氯化钠，0.5 M的三•/ Cl的pH值7.0）在室温下30分钟
12. 在蒸馏水冲洗3分钟
13. 前在55℃杂交1小时
14. 重复使用相同的探针杂交组合，含有55 ° C过夜杂交。
15. 洗净上文所述，除了在55 ° C。
16. 包装凝胶和揭露phosphorimager〜2小时。
17. 扫描phosphorimager。正常化之前变性，变性后获得的，获得的杂交信号。

2。确定端粒的终端适配器^结扎 6核苷酸

结扎原则（图2A及2B）：5'末端标记独特的寡核苷酸的3'结束的G悬。这是通过退火具体的互补指南寡核苷酸。只有独特/指导寡适配器轴承兼容的端粒G -悬端序列的序列，将结扎。 为 T 布氏 ，端粒可能终止在6个不同的核苷酸TTAGGG重复之一。因此，使用6个不同的指导oligoes（TG1 TG6，图2A）。结扎后，DNA限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶上解决。

1. 独特的寡核苷酸激酶治疗。
   混合3μL10倍PNK缓冲，6μL10 pmole /μL独特的寡核苷酸，5μL的^γ[32 P] _{ATP，DDH 2} O 14μL，2μLT4 PNK（10 U） 。在37 ° C为1小时孵育的混合物。
2. 删除非法人热核苷酸。
   使用Qiaquick核苷酸去除试剂盒，以消除非法人热（ATP）和结束标记的寡核苷酸洗脱，洗脱缓冲液60μL（终浓度会〜1 pmole /μL）。
3. 退火独特的寡核苷酸指导寡核苷酸（创建适配器）。
   添加10μL纯化独特的寡核苷酸2μL每个导寡核苷酸1μL，退火缓冲液（200 mM氯化钠，100毫米的Tris - HCl pH值8.0）。放入85℃加热块管和关闭热块。让冷却到RT管和热块。这将需要几个小时。如果有急事，传输管后5分钟至65 ° C，然后37 ° C，然后让它冷却到RT。
4. 结扎适配器总DNA。
   2.5μL完整的基因组DNA，加4μL5 ×连接酶缓冲液，10μL退火寡核苷酸，2.5μLDDH _2，1μLT4 DNA连接酶。孵育16℃过夜。
5. 酶切
   20μL连接产物加入3μL10 × NEB缓冲液4，1.5μLALUI和姆博伊每个，4μLDDH _{2 O}在37℃过夜孵育的混合物。
6. 电泳。
   每个样品中加入3μL10 ×橙G染料（50％的甘油，0.5％，橙G）。 0.2微克/ ml溴化乙锭，装入0.5 × TBE一个20X20厘米0.7％琼​​脂糖凝胶上的DNA样本。在30V运行30分钟，然后是Continue具有更高的电压，但比120V共有1000 V HR。以用尺子图片旁边的DNA标记的凝胶。
7. 干凝胶和揭露。
   DE81滤纸和两层3毫米的Whatman纸层琼脂糖凝胶，并用保鲜膜覆盖的凝胶。干凝胶在室温下。公开phosphorimager通宵干凝胶。

3。结扎介导的引^物延伸6

原则（图2A和2C）：一个独特的寡核苷酸是结扎3'与特定的终端序列的G -悬，取决于其在适配器（指导）寡核苷酸的互补序列。经纯化后，标记的指导寡核苷酸，退火G-overhang/unique寡是使用了T4 DNA聚合酶，缺乏链置换和5' - 3'核酸外切酶的活动扩展到SS - DS交界的引物。因此，引物延伸产品的G -悬的长度。

1. 引导和独特的oligoes激酶治疗
   1. 混合使用10μL10 × PNK缓冲液，20μL，5 ×连接酶缓冲液（其中包含10毫米ATP），3μLT4 PNK（30 U），47μLDDH ₂ 20μL10 pmole /μL独特的寡核苷酸。在37 ° C 60分钟的孵育的混合物。
   2. 混合1μL10 pmole /μL的指导寡核苷酸1μL，2μL的10 × PNK缓冲^γ[32 P] ATP，1μLT4 PNK（10 U），和5μLDDH _{2 O}在37 ° C 60分钟的孵育的混合物。
2. 退火寡核苷酸指导和独特的寡核苷酸
   加入10μL磷酸化的独特的寡核苷酸和结束标记引导寡核苷酸在1.5 mL Eppendorf管（独特的2:1的比例，引导寡确保所有指导寡核苷酸退火10μL（10 pmole）（20 pmole） ）。按照相同的步骤中的第二号议定书退火oligoes。
3. 端粒末端结扎的退火指南/独特的寡核苷酸适配器
   按照同样的步骤第二号议定书的DNA结扎。
4. 1 / 10体积的醋酸钠沉淀DNA和2.5体积的冰冷乙醇在-80 ° C为30分钟。 12 krpm，4℃离心15分钟，DNA沉淀。 70％的乙醇清洗DNA溶于10μLDDH _{2 O}托盘
5. 引物延伸
   每10μL的DNA样本，加2μL10 × T4 DNA聚合酶缓冲，1μL1 mg / mL的BSA，1μL25毫米的dATP，dCTP，dTTP的每1μLT4 DNA聚合酶（3 U），和3μLDDH _{2 O}
   请与聚合酶，缓冲等主组合，每个DNA样本等份适量的主结构。在30℃孵育30分钟。然后添加1.2μL0.5M EDTA立即反应。
6. 电泳
   运行在10％丙烯酰胺/ 7米urea/1xTBE凝胶的延伸产品。装入4μL每个样品。煮沸10分钟在装货前的样品。在800V 1X TBE运行，直到蓝色染料到达凝胶底部。干凝胶在65℃30分钟30分钟，然后在室温下暴露phosphorimager 2小时。
   要准备100毫升10％的聚丙烯酰胺凝胶，尿素41克和21毫升40％的丙烯酰胺溶液（丙烯酰胺/双丙烯酰胺29:1）溶于蒸馏水30毫升，加入10毫升10倍TBE。装配玻璃板。浇筑前的凝胶，加1毫升10％的APS和100μLTEMED。倒入胶，并尽量避免任何气泡。

4。代表性的成果：

检测T。布氏端粒G -悬结构，使用母语-凝胶杂交

完整的T。布氏由脉冲场凝胶电泳分离的染色体显示在图3A和3B（左侧面板）T 。 布氏细胞通常含有minichromosomes〜100份，所有具有类似规模（50-150 KB），并迁移到相同的位置（MC）凝胶。由于这一事实后，与TELC寡核苷酸探针的杂交，端粒的G -悬信号是最突出minichromosomes（图3A，中间面板）的。与TELG寡核苷酸探针杂交，一般不会产生任何杂交信号（图3B，中间面板），因为 T。 布氏细胞没有端粒的C悬结构。变性和中，与TELC或TELG寡核苷酸探针杂交后，应揭露对所有的染色体末端端粒信号（图3A及3B，右面板）。

确定端粒的终端适配器结扎核苷酸

载入等量的DNA在每个泳道是这个实验是必不可少的，这是用EB染色的凝胶甲基溴。如图4A所示，左边的面板就是一个例子。

在这个协议，结束标记独特的寡核苷酸和引导寡适配器只结扎染色体末端端粒的G -出挑指导寡兼容的序列结束。四 NCE独特的寡核苷酸末端标记，将放射性结扎产品，并给予强烈的信号。如图4A所示，右侧面板，巷1给出了一个强烈的信号，表明大量的unique/TG1适配器已结扎端粒结束。 TG1 5'CCCTAA3“的结束序列。因此，端粒的G -出挑这个适配器的一端结扎5'TTAGGG3“。没有观察结扎产品的大量使用其他引导oligoes，表明端粒在TTAGGG 结尾 T中占主导地位布氏细胞。

治疗埃克索我或埃克索T，它是特定的核酸3'悬的基因组DNA，造成损失的结扎产品（图右侧面板中，4A，泳道2和3），表明结扎确实从端粒摹悬结构

结扎介导的引物延伸

不结扎的末端标记的指导寡核苷酸是长22新台币。载入结束标记引导寡核苷酸作为一个阴性对照和大小标记。 （图4B，11巷，星号表示结束标记指导寡）。通常，我们也观察到这种消极的控制（图4B，11巷，开放的三角形），这是最有可能的残留物非变性适配器〜44 NT带。结扎后的染色体末端，延长产品的大小反映的G -悬结构的长度。大多数T。布氏端粒在5'TTAGGG3年底的G -出挑“（图4A）。然而，这些G -出挑似乎很短（仅10 NT长），产品从结扎TG1指导寡延长是远远长于指导寡（图4B，10巷），但他们允许结扎TG1适配器（图4A，右面板中，泳道1）。虽然只有少量TG4适配器连接到端粒末端（图4A，右面板中，6车道），结扎TG4延伸产品更长（图4B，7巷，箭头头部），最长的产品被~~ 55新台币。因此，我们观察到端粒两个类型的G -悬在 T 布氏细胞。主要端粒的G -出挑5'TTAGGG3“的结束，而是只〜10 NT长。很少端粒G -出挑5'GGGTTA3结束“，但可高达40 NT长。两种类型的G -悬敏感埃克索T（或埃克索我）治疗（图4A，右面板中，2巷，3，和7;图4B，1巷，箭）。

图1。本地凝胶杂交原理，左，自然条件下，结束标记TELC寡核苷酸探针只能与单链的G -丰富的端粒悬杂交。杂交的强度反映了端粒的G -悬的长度。右，变性后，东芝电梯有限公司寡核苷酸探针将与所有的端粒DNA杂交。代表总额的端粒DNA杂交的强度，并用于装载控制，以及最后的G -悬水平计算除以本地杂交信号，通过后变性获得的。

图2。适配器结扎，结扎介导的引物延伸的原则 （A）序列的独特性和六个指导oligoes。 （二）确定端粒的终端适配器结扎核苷酸。独特的寡核苷酸末端标记（标有红色星号），退火，以指导oligoes和结扎端粒。只有当独特/指导适配器熊3'悬，是与终端的端粒序列将予以结扎适配器兼容。 （三）在结扎介导的引物延伸，引导寡末端标记（标有红色星号）和退火处理，以独特的寡核苷酸之前结扎的染色体末端。只有轴承与G -悬兼容的3'悬独特/指导适配器将予以结扎。 ^表示结扎phophordiester债券。去除unligated寡核苷酸对后，将进行引物延伸，用T4 DNA聚合酶，缺乏链置换和5' - 3'核酸外切酶的活动。扩展引导寡核苷酸的最终长度，因此反映的G -悬的长度。

图3 T。布氏端粒G -悬结构分析本地凝胶杂交 （一）在凝胶与TELC寡核苷酸探针杂交。 （二） - 凝胶与TELG寡核苷酸探针杂交。在这两种（A）和（b）留，Ethedium溴化染色PFG。中东，原生的杂交结果。右，变性后的杂交结果。野生类型 T 布氏细胞。完好或埃克索我治疗的基因组DNA的脉冲电泳分离。开放的三角形代表的megabase染色体;集成电路，中等大小的染色体;管委会，minichromosomes。

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图4 T。布氏端粒结构的G -悬结扎介导的引物延伸分析 （一）大多数T.布氏端粒G -出挑终止5'TTAGGG3“。左，Ethedium溴化染色的DNA凝胶。装在每个泳道DNA的量大致相等。权利，接触相同的凝胶干燥后的结果。完整，出我的治疗，或埃克索处理的T - DNA连接到6个不同的结束标记的唯一/指导寡适配器表示。 （二）T布氏端粒短的G -出挑。完整或EXO T型治疗的基因组DNA克隆到六个不同的独特/指导的寡核苷酸引物使用T4 DNA聚合酶的延伸适配器。末端标记TG4寡核苷酸作为阴性对照组（11巷）加载。寡核苷酸本身运行在NT（*）22日也给了一个微弱的信号在44〜NT（Δ）。只有unique/TG4适配器取得了明显长于指导寡核苷酸（箭头，泳道7）延伸产品。

讨论

布氏锥虫引起睡在人类的疾病。这种疾病，如果不及时治疗，必然是致命的 T 。 布氏在哺乳动物宿主细胞进行定期抗原变异，以逃避宿主的免疫攻击^7。因此，它是非常难以消除T。布氏一旦感染细胞的建立。最近，我们已经证明， 端粒 T的表达调控发挥了重要作用布氏表面抗原基因^8。因此，重要的是进一步了解在 T端粒维持端粒的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem LE Agarose	Lonza Inc.	50004
Agarose Type VII (low melting agarose)	Sigma-Aldrich	A4018
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Roche Group	03 115801001
Exo I	New England Biolabs	M0293
Exo T	New England Biolabs	M0265
T7 exonuclease	New England Biolabs	M0263
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203
QIAquick nucleotide removal kit	Qiagen	28304