与预先定义的T细胞受体特异性Transnuclear小鼠对弓形虫获得通过体细胞核移植

摘要

我们证明，在这里，通过体细胞核移植（SCNT）后生重新编程可以作为一个工具来生成与预先定义的T细胞受体（TCR）特异性的小鼠模型使用。这些transnuclear小鼠表达​​内源性启动子的控制下的内源性轨迹相应的TCR。

摘要

淋巴细胞，如T细胞，进行基因V（D）J重组，生成具有一定的特异性受体^1。小鼠基因为一个重新安排的抗原特异性T细胞受体（TCR）已研究T细胞的发育和功能的一个不可缺少的工具。然而，这样的电阻温度系数有关T细胞长期培养后，经常反复的抗原刺激，不可避免地选择具有高亲和力的T细胞通常是孤立的。随机的TCR基因组融合α-和β链和非内源性促销员表达可导致表达水平和动力学的变化。

通过体细胞核移植后生重新编程，提供了一个工具来生成胚胎干细胞和小鼠细胞不涉及任何利益。因此，体细胞核移植是应用已知的特异性T细胞时，这些遗传V（D）J重排的体细胞核移植胚胎干细胞（ESC）和从中获得的小鼠，而表观遗传标记被复位。我们已经证明，与预先定义的特点对弓形虫 T细胞，可用于生成表示，从他们的内源性基因位点的具体TCR无基因改造实验介绍，小鼠模型。的速度，这样的transnuclear模型可以得到相对缓和和持有其他疾病模型建设的承诺。

研究方案

使用这种方法是，在报告的研究Kirak等 。，科学328（5975），243-248（2010 ） 。

1。供体细胞的分离

之前特定的T细胞或B细胞可以用来作为供体细胞产生transnuclear小鼠模型，小鼠感染病原体的利益需要或利益抗原免疫。既然我们已经使用了弓形虫具体的CD8 +细胞，以下协议描述的这些细胞，并根据个人利益的需要相适应的生成和隔离。

1. BL / 6 x的BALB / C F1（B6CF1）小鼠，从而使隔离的H - ^2，B和H - ² ð限制CD8 + T细胞，腹腔内注入从小鼠脑组织匀浆（约40）派生的囊肿。
2. 感染小鼠的免疫反应的高峰期，安乐死，脾分离并放置到一个含有6毫升红细胞（RBC）的裂解液的培养皿。
3. 使用两个封面幻灯片磨砂双方，脾仔细地面，并在室温下5分钟的红细胞裂解液孵育。
4. 添加14毫升PBS，通过细胞过滤器（40或70微米）过滤到50毫升猎鹰管300克5分钟离心的细胞悬液。
5. 去除上清液，重悬细胞沉淀在1 mL PBS和转移到1.5 mL Eppendorf管。离心300克5分钟，事后去除上清。
6. 在50μL的PBS重悬细胞沉淀，加入荧光标记的抗体，以确定感兴趣的细胞类型（如CD3 +，B220，CD8 +和CD4），荧光标记的MHC -Ⅰ四聚体（MHC -Ⅱ类分子四聚体的CD4 T细胞）加载感兴趣的肽的细胞悬液和30分钟的孵育在4 ° C
7. 加入1 mL PBS，300克，在3 mL PBS重悬沉淀5分钟离心，并通过细胞过滤器（40或70微米）过滤成管状的细胞悬液。
8. 执行严格设置大门（图1B）FACSorting。

2。体细胞核移植

体细胞核移植的几个协议。描述一个中期- II在被捕的卵母细胞和抑制的第二次减数分裂的细胞松弛素B。因此供体细胞的分裂是在G0/G1期。

1. 卵母细胞的制备
   1. BDF1背景的雌性小鼠的腹腔内注射5IU上午9时至下午5时和上午10时至下午7时之间每鼠标的PMS。
   2. 约47小时后，每只小鼠注射5IU HCG的腹腔内。
   3. 准备注射HCG当天的卵母细胞培养皿（KSOM - AA下油滴），并把它们放入孵化器_37℃，5％的CO 2。此外，准备必要的针体细胞核移植（7微米眼球摘除和4或淋巴细胞核的核移植5微米）与汞加载它们。
   4. 安乐死小鼠和隔离有关HCG后13h的输卵管（约上午08时）。收集1-2滴的HCZB输卵管。
   5. 一个由一搬进包含M2的瓦特/透明质酸下降输卵管。尼克仔细forcep输卵管和移动到下拉卵母细胞的卵丘复杂。经过所有的卵母细胞，卵丘复合物已被隔离，菜是培养在37 ° C。
   6. 2-5分钟后（确切时间取决于一批透明质酸酶）收集的卵母细胞，洗HCZB他们下降到KSOM - AA板。
2. 剜除卵母细胞
   1. 使用培养皿的盖子准备的体细胞核移植板。显微镜和显微操作。
   2. 眼球摘除开始之前，在PVP洗净眼球摘除针（7微米）。
   3. 眼球摘除，放入一个卵母细胞与细胞松弛素B（5微克/毫升）的HZCB下降组（10-30）。虽然孵化（至少5分钟）线的卵母细胞的水平。
   4. 一个卵母细胞和它放置在前面控股针。拿着针头的卵母细胞的修复采用真空。使用眼球摘除针，卵母细胞染色体主轴复杂（CSC，通常被称为“核心”），在3点钟位置，直到转。
   5. 使用压电脉冲渗透不破坏卵母细胞的透明带，仔细。将针相邻中期第二主轴的开放和应用真空。 “核心”应该缓慢移动，进针，一旦它被完全去除，膜应密封本身。
   6. 去核卵母细胞转移到KSOM - AA滴，并多次把它们洗干净。重复的电子一个新的卵母细胞的核步骤。继续，直到所有的鸡蛋都被摘除或约上午11时至。
3. 核移植
   1. 核传输，交换核转移针（​​4或5微米），用PVP的眼球摘除针（7微米）。
   2. 放入您感兴趣的细胞（如CD8 + T细胞）与PVP下降，拌匀孵育至少10分钟。
   3. 放入组（10-30）的去核卵母细胞与细胞松弛素B（2.5微克/毫升）的HCZB下降。虽然孵化（至少5分钟）通过核移植针行卵母细胞的水平。
   4. 从PVP的细胞悬液，拿起一个供体细胞和吸和，直到外膜破裂（细胞膜和细胞质的片段应该是可见的的）。如果有必要压电脉冲均可适用。一旦核已被隔离，将它一点点针，并继续，直到你有10-30拿起核。
   5. 移动包含对齐的去核卵母细胞的下降。真空应用，解决一个卵母细胞的控股针。将核移植针（原子核应远离开幕）相邻的透明带，适用于压电脉冲，通过透明带了，直到针。小心地将一个原子核针尖，针推入卵母细胞，直到针尖是2 / 3内。套用一个小的负压，使卵母细胞质膜的点点针。
   6. 接下来的步骤是非常关键的，因为它是唯一的一次卵母细胞实际上是“开放”时，。应用压电单脉冲，推针的核应用正压，小心地拉了回来针，使针尖在卵母细胞的1 / 3左右，然后施加负压力，并继续给拉了回来针密封的卵母细胞。重复此步骤，每一个卵母细胞。
   7. 组中的所有卵母细胞后收到一个原子核，它们洗净，培养KSOM - AA媒体。所有的卵母细胞重复此过程。
   8. 最后一组后一直在KSOM - AA至少30分钟的文化，体细胞核移植胚胎转移到含有氯化锶钙激活媒体的下降。
   9. 经过6个小时的激活，伪原核量（PPN）的阳性体细胞核移植胚胎是确定的。胚胎，然后洗净，在KSOM - AA培养滴，直到他们达到了胚泡的阶段，增加3.5天。
   10. 药物或化学品的选择（如曲古菌素A）可以添加到激活和文化传媒。

3.Derivati​​on的胚胎干细胞

可用于体细胞核移植的囊胚，要么转移到假孕的女性（又称直接或一步克隆）或胚胎干细胞（也称为间接或两步克隆）。因为它是更有效的产生ES细胞，我们选择了两个步骤。囊胚情况下，科学家是在直接克隆感兴趣，可以转移到假孕的女性直接在第5节描述。

有描述的胚胎干细胞衍生的许多协议。这里描述的是一个标准的技术，它采用饲养层细胞，胎牛血清。

1. 核移植后的第二天，准备胚胎干细胞衍生的96 U型孔板。
2. 加入100μL，明胶，以及到每一个96 - U孔板孵育至少10分钟，之后将其删除。
3. 解冻馈线细胞和悬浮在根据“公共服务电子化”的中期量，如饲养层细胞， ^相当于 25平方厘米的面积都在10毫升ESD介质和200μL的细胞悬液悬浮添加到每个明胶治疗。
4. 板放入孵化器和文化在37℃，5％的CO _2。
5. 经过3.5天，胚胎在囊胚阶段。
6. 电镀几滴ES细胞培养基和酸性可控硅整流准备无菌细菌培养皿。
7. 胚泡是首先从KSOM机管局滴转移到含有滴正常的ES细胞培养基洗涤两次。
8. 小心地转移到一滴酸性可控硅整流的囊胚组（5-10囊胚），并保持在那里，直到溶解透明带。
9. 的囊胚，然后转入下降与ES培养基，洗涤两次，然后放入馈线涂层的U - 96孔板（一到一个很好的囊胚）。
10. 胚胎体外培养5-7天孵化器在37℃，5％的CO _2，而不会干扰他们。这使胚胎的时间到ttach饲养层，形成一个产物。
11. 准备24孔板，每孔在ESD介质电镀馈线，如重新悬浮在12毫升的ESD介质相当于一个50厘米²馈线，并添加到每孔500μL的细胞悬液。
12. 小心地从“公共服务电子化”的媒介，与胚胎的U - 96孔板，每孔250微升HEPES（或PBS）的两倍洗，加50μL胰蛋白酶和5分钟左右在37 ° C。
13. 移液器上下多次，直到产物除了已经下降到一个单细胞悬液，转移到24孔板孵育37℃，5％的CO _2。
14. 如果ESC键推导是成功的，ESC键殖民地应该是可见的，经过7-10天。

4.Blastocyst注射

囊胚注射液是一种常规技术，产生任何一种转基因小鼠模型。重要的是要提的，需要定时以及囊胚注射，随后转移到假孕的女性。

1. 总理与PMS和HCG的雌性小鼠在第2.1节所述。注射HCG后把雌性小鼠与雄性小鼠（一名女性和每一个笼子里的雄性小鼠）。
2. 第二天，检查插头的女性。这是算作0.5dpc（天性交）。
3. 从2.1节所述，并在KSOM - AA培养额外的3天输卵管受精胚胎，然后孤立。
4. 准备囊胚注射液（3.5dpc）当天胚胎干细胞。
5. 取出胚胎干细胞培养基，HEPES（或PBS）洗两次，加入胰蛋白酶在37℃孵育5分钟° C。
6. 胰酶消化细胞悬浮ES介质，在培养皿中板，孵育45-60分钟，在37 ° C，5％的_CO 2减少的饲养层细胞（饲养层细胞坚持速度比ES细胞）的数量。
7. 成管状细胞悬液通过细胞过滤器（40或70微米）传输，并在1000RPM离心5分钟。
8. 删除冰上清，悬浮细胞沉淀，直到500μL，ES介质和存储需要。
9. 准备由电镀含滴PVP和HCZB无菌细菌培养皿的盖子。
10. 加载汞，放置位置和洗衣机与PVP准备15微米针头。
11. 放入一组囊胚（10-30囊胚）与HCZB下降，并添加到另一个HCZB下降5-50μLES细胞悬液（取决于浓度）。
12. 拿起ES细胞的注射针（50-100细胞）。
13. 移动到下拉的囊胚。水平对齐的囊胚，并修复与应用真空控股针之一。
14. 使用注射针转的囊胚内细胞团（ICM）“，直到在9点钟位置。
15. 放置在3点钟的注射针头，确保有针尖没有ES细胞，并注射针，直到通过透明带和成囊胚的滋养层穿透，适用于压电脉冲。
16. 发行数的ES细胞（5-15细胞），使胚胎干细胞粘到ICM。继续，直到已与ES细胞注入囊胚组中的所有。
17. 完成一组囊胚后，洗两次在KSOM - AA，并让他们在KSOM - AA下降，直到所有被注入囊胚。

5。胚胎移植

胚胎转移到假孕的女性代表一种外科手术，这需要进行非常仔细，并根据研究员的研究所的指导方针。

1. 麻醉雌性受体小鼠，刮胡子右下象限，和消毒。
2. 用剪刀打开的皮肤，从皮肤中分离出来的腹膜。
3. 找到卵巢，通过腹膜（红点），打开腹膜，卵巢接近。
4. 使用镊子，小心地抢输卵管和子宫拉出。
5. 毛细管连接到口吸管，拿起一组约10囊胚。
6. 修正了一个钳子宫，冲了进去一个小的整体，用一个小针头，并插入的毛细血管进入子宫腔的囊胚。
7. 小心地释放到子宫的胚胎，并删除您的毛细血管。
8. 推回子宫进入腹腔。
9. 找到腹膜边缘，并关闭它与几针。
10. 几个订书钉关闭鼠标的皮肤。
11. 对于手术后的疼痛，管理5微克每毫克体重卡洛芬。

体细胞核移植技术图1。B6CF1背景预先定义的T细胞的转移。 CD8 + T细胞和体细胞核移植囊胚的胚胎干细胞生成的胚胎的绝对和相对数量。

图2代表流量与体细胞核移植胚胎干细胞嵌合体小鼠注射的流式细胞仪分析。门和数量（每总CD8 + T细胞％）表明存在特异性CD8 + T细胞在嵌合体小鼠。

讨论

我们已经表明，可用于生成与预先定义的特异性T细胞的transnuclear小鼠体细胞核移植。虽然这里没有显示，该技术也应该可用与预先定义的特异性的B细胞产生的transnuclear小鼠。

一个重要的事情要考虑的是应变和性别的鼠标，这是感染或接种疫苗和用于隔离T或B细胞的兴趣。由于T细胞和B细胞有一个非常低的重编程效率一般，我们建议使用所需的单体型F1杂种。由于供体细胞也决定了性，我们建议使用从雄性小鼠的T或B细胞。这意味着，只有男性的嵌合体小鼠传输通过生殖细胞的TCR或BCR与雄性小鼠更容易和更快繁殖，。

两者合计，我们认为，通过体细胞核移植后生重新编程产生的小鼠模型的一种新型免疫学领域的巨大优势，这将是一个有力的工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Red Blood Cell lysis Buffer	Sigma-Aldrich	R7757
Cell strainer	BD Biosciences	REF 352340
Pregnant Mare Serum (PMS)	Calbiochem	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Calbiochem	230734
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272	Type IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Customized medium
Ca-free medium for activation	EMD Millipore	MR-174-D	Customized medium
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552	5mM = 1000x
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
Holding needle	Humagen	MPH-SM-30
Injection and transfer needles	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Mouth pipette	Sigma-Aldrich	A5177
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	or something similar
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	or something similar
Wound Clip Applicator	BD Biosciences	427630
Wound Clips	BD Biosciences	427630
Suture	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamin	MP Biomedicals	101806	200mM = 100x
Non-essential Aminoacids	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl in 500ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK inhibitor	Cell Signaling Technology	9900L	For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM)