Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Resumen

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Resumen

Linfocitos, como las células T, se someten genética V (D) J recombinación, para generar un receptor con una cierta especificidad ^1. Ratones transgénicos para reorganizar el antígeno específico de los receptores de células T (TCR) ha sido una herramienta indispensable para estudiar el desarrollo de células T y la función. Sin embargo, los TCR son por lo general aislado de las células T después de la correspondiente a largo plazo la cultura a menudo después de la estimulación repetida de antígenos, que inevitablemente selecciona las células T con alta afinidad. Integración al azar del genoma de la TCR α-β y de la cadena y la expresión de la no endógena promotores pueden dar lugar a variaciones en el nivel de expresión y la cinética.

Reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas es una herramienta para generar células madre embrionarias y los ratones de cualquier célula de interés. En consecuencia, cuando SCNT se aplica a las células T de especificidad conocida, estos recursos genéticos V (D) J reordenamientos se transfieren a las células madre embrionarias-SCNT (CES) y los ratones derivadas de ellos, mientras que las marcas epigenéticas se restablecen. Hemos demostrado que las células T con pre-definido las especificidades contra Toxoplasma gondii se puede utilizar para generar modelos de ratones que expresan el TCR específicos de sus loci endógena, sin modificación genética introducida experimentalmente. La relativa facilidad y rapidez con que estos modelos transnuclear se puede obtener una promesa para la construcción de modelos de otras enfermedades.

Protocolo

Este método se utilizó en la investigación publicada en Kirak et al., Science 328 (5975), desde 243 hasta 248 (2010) .

1. El aislamiento de las células del donante

Antes de T específicos o de células B se puede utilizar como donantes de células para generar modelos de transnuclear ratón, ratones necesidad de estar infectados con un patógeno de interés o inmunizados con un antígeno de interés. Puesto que hemos utilizado las células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, el siguiente protocolo se describe la generación y el aislamiento de estas células y tiene que adaptarse de acuerdo al interés personal.

1. Quistes derivados de un homogeneizado de cerebro de ratón (40) se inyectan intraperitonealmente en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) ratones, lo que permite el aislamiento de H-2 ^b y H-2 ^d restringido células T CD8 +.
2. En el pico de la respuesta inmune, el ratón infectado es la eutanasia, el bazo aisladas y se coloca en un plato con 6 ml de células rojas de la sangre (glóbulos rojos) de tampón de lisis.
3. Utilizando los lados mate de dos diapositivas de cobertura, el bazo es cuidadosamente suelo y se incubaron en el buffer de lisis durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir 14 ml de PBS, filtrar la suspensión de células a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 gramos.
5. Extraer el sobrenadante, resuspender el botón celular en 1 ml de PBS y la transferencia en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 300g y eliminar el sobrenadante después.
6. Resuspender el botón celular en 50 l de PBS, añadir anticuerpos marcados con fluorescencia para identificar el tipo de células de interés (por ejemplo, CD3, B220, CD8 y CD4), y marcados con fluorescencia tetrámero MHC-I (MHC-II tetrámero de las células T CD4) que se carga con el péptido de interés para la suspensión de células y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
7. Añadir 1 ml de PBS, centrifugar durante 5 min a 300 g de pellets, resuspender en 3 ml de PBS, y el filtro de la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo.
8. FACSorting realizar mediante el establecimiento de las puertas de la estricta (fig. 1B).

2. Transferencia nuclear de células somáticas

Hay algunos protocolos para la transferencia nuclear de células somáticas. El que se describe aquí hace uso de ovocitos detenidos en metafase II y la inhibición de la segunda división meiótica con citocalasina B. Por lo tanto, las células del donante son necesarios que se encuentran en la fase G0/G1.

1. Preparación de los ovocitos
   1. Los ratones hembra de BDF1 fondo se inyectan intraperitonealmente con 5IU PMS por ratón 17:00-19:00.
   2. Alrededor de 47 horas más tarde, cada ratón se inyecta intraperitonealmente con 5IU HCG.
   3. Prepare una placa de cultivo (KSOM-AA petróleo cae por debajo) de los ovocitos en el mismo día de la inyección de hCG y se colocan en una incubadora 37 ° C, 5% de CO _2. Además, preparan las agujas necesarias para la SCNT (7μm de enucleación y 4 o 5μm para la transferencia nuclear de los núcleos de linfocitos) cargándolos con mercurio.
   4. La eutanasia a los ratones y aislar a los oviductos de 13h después de HCG (aproximadamente las 8 AM). Recoge los oviductos en 1-2 gotas de HCZB.
   5. Uno por uno, los oviductos se mueven en un desplegable que contiene M2 w / hialuronidasa. Nick el oviducto cuidadosamente con una pinza y mover el ovocito-cumulus-compleja en la caída. Después de todo ovocitos cumulus-complejos se han aislado, el plato se incuba a 37 ° C.
   6. Después de 2-5 minutos (el tiempo exacto depende de la hornada de hialuronidasa) recoger los ovocitos, lávate en HCZB y la placa que en KSOM-AA gotas.
2. Enucleación de ovocitos
   1. Use la tapa de una caja de Petri para preparar el plato SCNT. Configurar el microscopio, y el micromanipulador.
   2. Lave la aguja enucleación (7 m) en PVP antes de comenzar con la enucleación.
   3. De enucleación, colocar un grupo de ovocitos (10-30) en una gota de HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 minutos) hasta la línea de los ovocitos en posición horizontal.
   4. Tome un ovocito y lo coloca en frente de la aguja de la celebración. Fijar el ovocito de la celebración de la aguja mediante la aplicación de un vacío. Con la aguja de la enucleación, a su vez el ovocito hasta que el cromosoma eje del complejo (CSC, a menudo llamado el "núcleo") se encuentra en la posición de las 3.
   5. Utilizando piezo-pulso penetrar la zona pelúcida con cuidado, sin dañar el óvulo. Lugar la apertura de la aguja al lado del eje de la metafase II y aplicar vacío. El "núcleo" debe moverse lentamente hacia la aguja, y la membrana se debe sellar una vez que se elimina por completo.
   6. La transferencia de los ovocitos enucleados de nuevo en las gotas KSOM-AA, y lavarlos varias veces. Repita el correomedidas de nucleación con un nuevo grupo de ovocitos. Continúe hasta que todos los huevos se enucleado o hasta unos 11.
3. Transferencia nuclear
   1. Para la transferencia nuclear, el intercambio de la aguja de la enucleación (7 m) con una aguja de transferencia nuclear (4 o 5 m) y se lava con PVP.
   2. Lugar a las células de interés (por ejemplo, las células CD8 + T) en una gota de PVP, mezclar bien e incubar durante un mínimo de 10 min.
   3. Lugar a un grupo de ovocitos enucleados (10-30) en una gota de HCZB con citocalasina B (2,5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 min) línea de ovocitos horizontal mediante el uso de la aguja de transferencia nuclear.
   4. Recoger una célula donante de la suspensión de PVP-célula y aspirado que dentro y fuera, hasta que la membrana externa se ha roto (fragmentos de la membrana y el citosol debe ser visible). Si es necesario un piezo-pulso se puede aplicar. Una vez que el núcleo ha sido aislado, moverlo un poco en la aguja, y continuar a recoger a los núcleos hasta que tenga 10 a 30.
   5. Mover a la caída que contienen los ovocitos enucleados alineados. Fijar un ovocito para la celebración de la aguja mediante la aplicación de vacío. Coloque la aguja de transferencia nuclear (el núcleo debe estar lejos de la apertura), adyacente a la zona pelúcida y aplicar piezo-pulso hasta que la aguja ha atravesado la zona pelúcida. Cuidadosamente el movimiento de un núcleo a la punta de la aguja, introduzca la aguja en el óvulo hasta que la punta de la aguja es de 2 / 3 en el interior. Aplique una pequeña presión negativa, de modo que un poco de la membrana del ovocito está en la aguja.
   6. El siguiente paso es muy importante, ya que es la única vez que el ovocito es en realidad "abierta". Aplicar un pulso de piezo, empuje el núcleo de la aguja mediante la aplicación de presión positiva, cuidadosamente retire la aguja de modo que la punta es aproximadamente 1 / 3 en el ovocito, y luego aplicar presión negativa y siguen a retirar la aguja sellar el ovocito. Repita este paso con cada ovocito.
   7. Después de todos los ovocitos de un grupo han recibido un núcleo, se lavan y se cultivan en KSOM-AA medios de comunicación. Repita este procedimiento con todos los ovocitos.
   8. Después de que el último grupo ha sido en las culturas KSOM-AA por un mínimo de 30 minutos, la SCNT-embriones son transferidos en forma de gotas de los medios de activación de Ca-libre que contiene SrCl2.
   9. Después de 6 horas de la activación, la cantidad de pseudo-pronúcleos (PPN)-positivos SCNT-embriones se determina. Los embriones se lavan y se cultivaron en KSOM-AA gotas de otros 3,5 días hasta que han llegado a la etapa de blastocisto.
   10. Drogas o productos químicos de la elección (por ejemplo, tricostatina A) se puede agregar a la activación y medios de cultivo.

3.Derivation de células madre embrionarias

Los blastocistos SCNT, se puede utilizar a cualquiera de ellos en la transferencia de pseudo-embarazadas las mujeres (también conocida como clonación directa o un paso) o para obtener células madre embrionarias (también conocida como clonación indirecta o de dos). Ya que es mucho más eficiente para generar células madre embrionarias, se elige el procedimiento de dos pasos. En caso de que el científico está interesado en la clonación directa, los blastocitos se pueden transferir directamente a las mujeres embarazadas pseudo-como se describe en la sección 5.

Existen muchos protocolos que describen la obtención de células madre embrionarias. El que se describe aquí es una técnica estándar, que utiliza células alimentadoras, y suero fetal bovino.

1. El segundo día después de la transferencia nuclear, preparar una placa de 96-U-y para la derivación de células ES.
2. Añadir 100 ml de gelatina en cada pocillo de una placa de 96 U, bueno, se incuba durante un mínimo de 10 minutos y retirarla después.
3. Descongelar las células de alimentación y resuspender en un volumen de medio de la EDS de acuerdo, por ejemplo células de alimentación equivale a un área de 25 cm ² se resuspenden en 10 ml de medio EDS y 200 l de la suspensión celular, se añade en cada una de las de gelatina bien tratados.
4. Colocar la placa en una incubadora y la cultura a 37 ° C, 5% de CO _2.
5. Después de 3,5 días, los embriones debe estar en el estadio de blastocisto.
6. Preparar un plato de bacterias en placas estériles ES un medio de unas gotas de células y thyrode ácido.
7. Los blastocistos se transfieren primero de las gotas KSOM-AA en gotas que contienen medio normal de las células ES y lavado dos veces.
8. Con cuidado, la transferencia de un grupo de blastocistos (blastocistos 5-10) en una gota de ácido thyrode y mantenerse en ella hasta la zona pelúcida se haya disuelto.
9. Los blastocistos se transfieren a una caída con el medio ES, se lavaron dos veces, y luego se colocan en el alimentador recubiertos de 96 U y placa (un blastocisto en un pozo).
10. Los embriones son cultivados durante 5-7 días en una incubadora a 37 ° C CO, 5% ₂ sin molestarlos. Esto permite que el embrión de unattach a la capa de alimentación, y para formar una consecuencia.
11. Prepare 24 y placas, por sistemas de siembra en medio de la EDS en cada pozo, por ejemplo, volver a suspender el equivalente de 50 cm ² de alimentación en 12 ml de medio ESD, y añadir 500 l de la suspensión celular en cada pocillo.
12. Retire con cuidado el medio de la EDS de la placa de 96-U-bien con los embriones, lave cada pocillo dos veces con 250 l Hepes (o PBS), se añaden 50 l de tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C.
13. Pipeta hacia arriba y abajo varias veces, hasta que fruto se ha derrumbado en una suspensión de una sola célula, el traslado en una placa de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C CO, 5% _2.
14. Si la derivación de ESC fue un éxito, las colonias de ESC debe ser visible después de 7-10 días.

4.Blastocyst inyección

La inyección de blastocistos es una técnica de rutina para generar cualquier tipo de modelo de ratón transgénico. Es importante mencionar que la inyección de blastocistos y el posterior traslado en pseudo-embarazadas las mujeres tiene que ser oportuna.

1. Primer ratones hembra con el síndrome premenstrual y HCG como se describe en la sección 2.1. Después de la inyección de HCG poner los ratones hembra con ratones macho (una hembra y un ratón macho por jaula).
2. Al día siguiente, marque las mujeres para los enchufes. Esto se cuenta como 0.5dpc (días después del coito).
3. Embriones fecundados se aisló del oviducto como se describe en la sección 2.1, y se cultivan en KSOM-AA durante 3 días.
4. Prepare las células ES en el día de la inyección de blastocisto (3.5dpc).
5. Quitar medio de células madre embrionarias, lavar dos veces con Hepes (o PBS), agregar la tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C.
6. Resuspender trypsinized células con medio de ES, la placa en un plato, y se incuba durante 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ para reducir la cantidad de células alimentadoras (células alimentadoras se adhieren más rápido que las células ES).
7. Transferir la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo y centrifugar durante 5 min a 1000 rpm.
8. Extraer el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 500 l medio ES y almacenar en hielo hasta que se necesite.
9. Prepare la tapa de un recipiente estéril de bacterias en forma de gotas que contienen placas PVP y HCZB.
10. Prepare una aguja 15 micras por la carga de mercurio, colocándolo en posición y lavarlo con PVP.
11. Lugar a un grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) en una caída con HCZB, y añadir 5-50 l suspensión de células ES (depende de la concentración) en una gota de HCZB.
12. Recoger células madre embrionarias (50-100 células) con la aguja de inyección.
13. Mover a la caída de los blastocitos. Alinear los blastocitos en posición horizontal, y fijar una con la aguja de la celebración mediante la aplicación de vacío.
14. Con la aguja de la inyección a su vez el blastocisto hasta que la masa celular interna (ICM) se encuentra en la posición de las 9.
15. Coloque la aguja de inyección a las 3 horas, asegúrese de que no hay células madre embrionarias en la punta de la aguja, y aplicar piezo-el pulso hasta que la aguja penetra a través de la zona pelúcida y la trophectoderm en el blastocele.
16. Lanzar una células madre embrionarias pocos (5-15 células), de modo que las células madre embrionarias se adhieren a la ICM. Continúe hasta que todos los blastocistos del grupo han sido inyectados con células madre embrionarias.
17. Después de un grupo de blastocistos es terminado, lavar dos veces en KSOM-AA y mantenerlos en una caída con KSOM-AA hasta que todos los blastocistos se inyectan.

5. Transferencia de Embriones

La transferencia de embriones en mujeres embarazadas pseudo-representa un procedimiento quirúrgico, que debe llevarse a cabo con mucho cuidado y de acuerdo con las directrices del Instituto del investigador.

1. Anestesiar a los ratones hembra receptora, afeitarse el cuadrante inferior derecho, y desinfectar.
2. Utilizando unas tijeras abiertas en la piel, y separar el peritoneo de la piel.
3. Localizar el ovario a través del peritoneo (punto rojo), y abrir el peritoneo, en las proximidades del ovario.
4. Con una pinza, coger con cuidado el oviducto y sacar el útero.
5. Recoger a un grupo de alrededor de 10 blastocistos con un capilar conectado a una pipeta de boca.
6. Fijar el útero con una pinza, abra un conjunto pequeño en él con una pequeña aguja e insertar el tubo capilar con los blastocistos en el lumen del útero.
7. Con cuidado, la liberación de los embriones en el útero, y quitar el capilar.
8. Empujar el útero en la cavidad abdominal.
9. Localizar los bordes del peritoneo y cerrar con unas cuantas puntadas.
10. Cerca de la piel del ratón con algunas grapas.
11. Para el dolor postoperatorio, administrar 5 mg por Carprofen mg de peso corporal.

Figura 1. Nuclear de células somáticastransferencia de pre-definidas las células T en B6CF1 fondo. Número absoluto y relativo de los embriones generados a partir de las células CD8 + T y las células madre embrionarias derivadas de blastocistos SCNT.

Figura 2. Análisis de flujo de citometría de Representante de los ratones quiméricos inyectados con SCNT células madre embrionarias. Puerta y el número (porcentaje total de células T CD8 +) indica la presencia de determinadas células CD8 + T en ratones quiméricos.

Discusión

Hemos demostrado aquí que la SCNT puede ser utilizado para generar ratones transnuclear de las células T con especificidad predefinida. Aunque no se muestra aquí, la técnica también podría ser útil para generar ratones transnuclear de las células B, con pre-definidos de especificidad.

Una cosa importante a considerar es la cepa y el sexo del ratón, que está infectado o vacunado y se utiliza para aislar células T o B de interés. Dado que las células T y B tienen una muy baja eficiencia de reprogramación en general, se recomienda el uso de híbridos F1 haplotipo deseado. Debido a que la célula donante también determina el sexo, se recomienda el uso de T o células B de ratones machos. Esto significa que sólo los ratones quiméricos hombres que transmiten el TCR o BCR a través de la línea germinal, con ratones machos ser más fácil y más rápido para reproducirse.

En conjunto, creemos que a través de la reprogramación epigenética SCNT representa una poderosa herramienta para generar un nuevo tipo de modelos de ratón, que será de gran ventaja para el campo inmunológico.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Red Blood Cell lysis Buffer	Sigma-Aldrich	R7757
Cell strainer	BD Biosciences	REF 352340
Pregnant Mare Serum (PMS)	Calbiochem	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Calbiochem	230734
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272	Type IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Customized medium
Ca-free medium for activation	EMD Millipore	MR-174-D	Customized medium
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552	5mM = 1000x
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
Holding needle	Humagen	MPH-SM-30
Injection and transfer needles	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Mouth pipette	Sigma-Aldrich	A5177
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	or something similar
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	or something similar
Wound Clip Applicator	BD Biosciences	427630
Wound Clips	BD Biosciences	427630
Suture	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamin	MP Biomedicals	101806	200mM = 100x
Non-essential Aminoacids	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl in 500ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK inhibitor	Cell Signaling Technology	9900L	For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM)